Summary

Quantitative Mikrotubuli-Fraktionierungstechnik zur Trennung von stabilen Mikrotubuli, labilen Mikrotubuli und freiem Tubulin in Mausgewebe

Published: November 17, 2023
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Summary

Mikrotubuli, bei denen es sich um Tubulin-Polymere handelt, spielen eine entscheidende Rolle als Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen und sind für ihre dynamische Instabilität bekannt. In dieser Studie wurde eine Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli entwickelt, um sie in stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freies Tubulin zu trennen, um die Stabilität von Mikrotubuli in verschiedenen Mausgeweben zu bewerten.

Abstract

Mikrotubuli, die aus α/β-Tubulin-Dimeren bestehen, sind ein entscheidender Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen. Diese röhrenförmigen Polymere weisen eine dynamische Instabilität auf, da Tubulin-Heterodimer-Untereinheiten einer repetitiven Polymerisation und Depolymerisation unterzogen werden. Die präzise Kontrolle der Stabilität und Dynamik der Mikrotubuli, die durch posttranslationale Tubulinmodifikationen und Mikrotubuli-assoziierte Proteine erreicht wird, ist für verschiedene zelluläre Funktionen unerlässlich. Funktionsstörungen in Mikrotubuli sind stark an der Pathogenese beteiligt, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Die laufende Forschung konzentriert sich auf auf Mikrotubuli-gerichtete Therapeutika, die die Stabilität modulieren und potenzielle Behandlungsoptionen für diese Krankheiten und Krebsarten bieten. Daher ist das Verständnis des dynamischen Zustands von Mikrotubuli entscheidend für die Beurteilung des Krankheitsverlaufs und der therapeutischen Effekte.

Traditionell wurde die Dynamik von Mikrotubuli in vitro oder in kultivierten Zellen durch grobe Fraktionierung oder Immunoassay untersucht, wobei Antikörper verwendet wurden, die auf posttranslationale Modifikationen von Tubulin abzielen. Die genaue Analyse des Tubulinstatus in Geweben mit solchen Verfahren stellt jedoch eine Herausforderung dar. In dieser Studie haben wir eine einfache und innovative Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli entwickelt, um stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freies Tubulin in Mausgeweben zu trennen.

Das Verfahren beinhaltete die Homogenisierung von präpariertem Mausgewebe in einem Mikrotubuli-stabilisierenden Puffer in einem Volumenverhältnis von 19:1. Die Homogenate wurden dann durch einen zweistufigen Ultrazentrifugationsprozess nach anfänglicher langsamer Zentrifugation (2.400 × g) fraktioniert, um Ablagerungen zu entfernen. Der erste Ultrazentrifugationsschritt (100.000 × g) fiel stabile Mikrotubuli aus, während der resultierende Überstand einem zweiten Ultrazentrifugationsschritt (500.000 × g) unterzogen wurde, um labile Mikrotubuli und lösliche Tubulindimere zu fraktionieren. Mit dieser Methode wurden die Anteile von Tubulin, die stabile oder labile Mikrotubuli im Mäusegehirn bilden, bestimmt. Darüber hinaus wurden deutliche Gewebevariationen in der Mikrotubuli-Stabilität beobachtet, die mit der proliferativen Kapazität der konstituierenden Zellen korrelierten. Diese Ergebnisse unterstreichen das signifikante Potenzial dieser neuartigen Methode zur Analyse der Mikrotubuli-Stabilität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Introduction

Mikrotubuli (MTs) sind längliche röhrenförmige Strukturen, die aus Protofilamenten bestehen, die aus α/β-Tubulin-Heterodimer-Untereinheiten bestehen. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei verschiedenen zellulären Prozessen wie Zellteilung, Motilität, Formerhaltung und intrazellulärem Transport und sind damit integrale Bestandteile des eukaryotischen Zytoskeletts1. Das Minus-Ende von MTs, bei dem die α-Tubulin-Untereinheit exponiert ist, ist relativ stabil, während das Plus-Ende, bei dem die β-Tubulin-Untereinheit exponiert ist, eine dynamische Depolymerisation und Polymerisation erfährt2. Dieser kontinuierliche Zyklus der Tubulin-Dimer-Addition und -Dissoziation am Plus-Ende, der als dynamische Instabilität bezeichnet wird, führt zu einem sich wiederholenden Prozess der Rettung und Katastrophe3. MTs weisen fokale Domänen mit lokalisierten Variationen der dynamischen Instabilität auf, einschließlich stabiler und labiler Domänen4.

Die präzise Kontrolle der dynamischen Instabilität von MTs ist entscheidend für zahlreiche zelluläre Funktionen, insbesondere in Neuronen, die durch komplizierte Morphologien gekennzeichnet sind. Die Anpassungsfähigkeit und Haltbarkeit von MTs spielen eine entscheidende Rolle für die Entwicklung und das reibungslose Funktionieren von Nervenzellen 5,6,7. Es wurde festgestellt, dass die dynamische Instabilität von MTs mit verschiedenen posttranslationalen Modifikationen (PTMs) von Tubulin verbunden ist, wie z. B. Acetylierung, Phosphorylierung, Palmitoylierung, Detyrosinierung, Delta 2, Polyglutaminoxidation und Polyglycylierung. Darüber hinaus dient die Bindung von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs) als Regulationsmechanismus8. PTMs, mit Ausnahme der Acetylierung, treten überwiegend in der Tubulin-Carboxy-terminalen Region auf, die sich auf der äußeren Oberfläche von MTs befindet. Diese Modifikationen erzeugen unterschiedliche Oberflächenbedingungen auf MTs, beeinflussen deren Wechselwirkung mit MAPs und steuern letztendlich die MT-Stabilität9. Das Vorhandensein eines carboxyterminalen Tyrosinrests in α-Tubulin ist ein Hinweis auf dynamische MTs, die schnell durch den freien Tubulinpool ersetzt werden. Umgekehrt bedeuten die Detyrosinierung des Carboxy-Terminus und die Acetylierung von Lys40 stabile MTs mit reduzierter dynamischer Instabilität 9,10.

Die PTMs von Tubulin wurden in großem Umfang in Experimenten eingesetzt, um die Dynamik und Stabilität von MTs 5,7,11,12,13,14,15 zu bewerten. Zum Beispiel können Tubuline in Zellkulturstudien in zwei Pools unterteilt werden: den freien Tubulin-Pool und den MT-Pool. Dies wird erreicht, indem freies Tubulin durch Zellpermeabilisierung freigesetzt wird, bevor die verbleibenden MTs 15,16,17,18,19 fixiert werden. Biochemische Methoden beinhalten die Verwendung chemischer MT-Stabilisatoren, die MTs vor Katastrophen schützen und die Trennung von MTs und freiem Tubulin durch Zentrifugation ermöglichen20,21,22. Diese Verfahren unterscheiden jedoch nicht zwischen stabilen und weniger stabilen (labilen) MTs, wodurch es unmöglich ist, MTs oder lösliches Tubulin in Geweben wie dem Gehirn zu quantifizieren. Folglich hat sich die Bewertung der MT-Stabilität in Organismen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen als schwierig erwiesen. Um diese experimentelle Einschränkung zu adressieren, haben wir eine neuartige Technik zur präzisen Trennung von MTs und freiem Tubulin in Mausgewebe entwickelt23.

Diese einzigartige MT-Fraktionierungsmethode beinhaltet die Homogenisierung von Gewebe unter Bedingungen, die den Tubulinstatus im Gewebe aufrechterhalten, und die zweistufige Zentrifugation zur Trennung stabiler MTs, labiler MTs und freiem Tubulin. Dieses einfache Verfahren kann auf breit angelegte Studien angewendet werden, einschließlich Grundlagenforschung zu MTs und MAPs in lebenden Organismen, physiologische und pathologische Analysen von Gesundheit und Krankheiten, die mit der MT-Stabilität verbunden sind, sowie die Entwicklung von Medikamenten und anderen Therapeutika, die auf MTs abzielen.

Protocol

1. Methode der MT-Fraktionierung HINWEIS: Alle Experimente, die in dieser Studie durchgeführt wurden, wurden von der Tierethikkommission der Doshisha-Universität genehmigt. Hier wurden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 3-4 Monaten verwendet. In diesem Protokoll wurden präparierte Gewebe, z. B. Gehirn, Leber oder Thymusdrüse, sofort in eiskaltem Mikrotubuli-Stabilisierungspuffer (MSB) homogenisiert, der Taxol (MT-Stabilisator) in einer Konzentration enthielt,…

Representative Results

Quantifizierung von Tubulin in den P2-, P3- und S3-Fraktionen des Mäusegehirns mit der MT-FraktionierungsmethodeTubulin im Mausgewebe wurde mit der MT-Fraktionierungsmethode in die P2-, P3- und S3-Fraktionen aufgeteilt und durch Western Blot quantifiziert (Abbildung 1A). Die Ausfällung von MTs, die durch Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für 20 min in der P2-Fraktion verblieben waren, machte 34,86 % ± 1,68 % des gesamten Tubulins in einem Mausgehirn aus. …

Discussion

Die wichtigste Aufgabe bei der Untersuchung des Status von Tubulin in Gewebe lebender Organismen besteht darin, eine versehentliche MT-Polymerisation oder -Depolymerisation während der Präparation zu verhindern. Die Stabilität von MTs in Proben wird durch Faktoren wie die Konzentration von Taxol in MSB, das Verhältnis der Gewebemenge zum Puffer und die Temperatur während des Prozesses von der Gewebeentnahme bis zur Homogenisierung und Zentrifugation beeinflusst. Daher wurden die Bedingungen in jedem Schritt des Prot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde zum Teil von JST unterstützt, der Einrichtung von Universitätsstipendien zur Schaffung von wissenschaftlich-technologischen Innovationen (A.HT.; JPMJFS2145), JST FRÜHLING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), ein Grant-in-Aid for Scientific Research(B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), ein Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas mit dem Titel “Brain Protein Aging and Dementia Control” von MEXT (TM; 26117004) und von Uehara Research Fellowship von der Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Materials

1.5 ML TUBE CASE OF 500 Beckman Coulter 357448
1A2 Sigma-Aldrich T9028 1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Nacalai Tesque 02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column Aproscience PT-1013
6-11B1 Sigma-Aldrich T7451 1:5,000 dilution
AKTA prime plus Cytiva
anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-035-146 1:5,000 dilution
antipain Peptide Institute Inc. 4062
aprotinin Nacalai Tesque 03346-84
Chemi-Lumi One L Nacalai Tesque 07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system Corning 430758 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP Sigma-Aldrich 55-91-4 
DIGITAL HOMOGENIZER AS ONE HOM
DM1A Sigma-Aldrich T9026 1:5,000 dilution
DTT Nacalai Tesque 14128-46
EGTA Nacalai Tesque 37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll Pall Corporation BSP0161
glycerol Nacalai Tesque 17018-25
GTP Nacalai Tesque 17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman TOMY
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column Cytiva 28-9893-35
Image Gauge Software  FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD  FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation 292-69903
KMX-1 Millipore MAB3408 1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin Peptide Institute Inc. 43449-62
MgSO4 Nacalai Tesque 21003-75
Na3VO4 Nacalai Tesque 32013-92
NaF Nacalai Tesque 31420-82
okadaic acid LC Laboratories O-2220 
OPTIMA MAX-XP Beckman Coulter 393315
pepstatin Nacalai Tesque 26436-52
PMSF Nacalai Tesque 27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 Beckman Coulter 343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) Roche 5056489001
Purified tubulin  Cytoskeleton T240
QSONICA Q55 QSonica Q55
Taxol LC Laboratories P-9600
TLA-120.2 rotor Beckman Coulter 357656
TLA-55 rotor Beckman Coulter 366725
TLCK Nacalai Tesque 34219-94
Triton X-100 Nacalai Tesque 12967-45
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

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Cite This Article
Hagita-Tatsumoto, A., Miyasaka, T. Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (201), e63358, doi:10.3791/63358 (2023).

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