Mikrotubuli, som är tubulinpolymerer, spelar en avgörande roll som en cytoskelettkomponent i eukaryota celler och är kända för sin dynamiska instabilitet. Denna studie utvecklade en metod för fraktionering av mikrotubuli för att separera dem i stabila mikrotubuli, labila mikrotubuli och fria tubuli för att utvärdera stabiliteten hos mikrotubuli i olika musvävnader.
Mikrotubuli, som består av α/β-tubulindimerer, är en avgörande komponent i cytoskelettet i eukaryota celler. Dessa rörliknande polymerer uppvisar dynamisk instabilitet när tubulinheterodimersubenheter genomgår repetitiv polymerisation och depolymerisation. Exakt kontroll av mikrotubulistabilitet och dynamik, uppnådd genom tubulin posttranslationella modifieringar och mikrotubuliassocierade proteiner, är avgörande för olika cellulära funktioner. Dysfunktioner i mikrotubuli är starkt inblandade i patogenes, inklusive neurodegenerativa sjukdomar. Pågående forskning fokuserar på mikrotubuliriktade terapeutiska medel som modulerar stabiliteten, vilket erbjuder potentiella behandlingsalternativ för dessa sjukdomar och cancerformer. Att förstå mikrotubulis dynamiska tillstånd är därför avgörande för att bedöma sjukdomsprogression och terapeutiska effekter.
Traditionellt har mikrotubulidynamiken utvärderats in vitro eller i odlade celler genom grov fraktionering eller immunanalys, med hjälp av antikroppar riktade mot posttranslationella modifieringar av tubulin. Att noggrant analysera tubulinstatus i vävnader med hjälp av sådana procedurer innebär dock utmaningar. I denna studie utvecklade vi en enkel och innovativ mikrotubulifraktioneringsmetod för att separera stabila mikrotubuli, labila mikrotubuli och fritt tubuli i musvävnader.
Proceduren innebar homogenisering av dissekerade musvävnader i en mikrotubulistabiliserande buffert med ett volymförhållande på 19:1. Homogenaten fraktionerades sedan genom en ultracentrifugeringsprocess i två steg efter en inledande långsam centrifugering (2 400 × g) för att avlägsna skräp. Det första ultracentrifugeringssteget (100 000 × g) fällde ut stabila mikrotubuli, medan den resulterande supernatanten utsattes för ett andra ultracentrifugeringssteg (500 000 × g) för att fraktionera labila mikrotubuli och lösliga tubulindimerer. Denna metod bestämde proportionerna av tubulin som utgör stabila eller labila mikrotubuli i mushjärnan. Dessutom observerades distinkta vävnadsvariationer i mikrotubulistabilitet som korrelerade med den proliferativa kapaciteten hos de ingående cellerna. Dessa fynd belyser den betydande potentialen hos denna nya metod för att analysera mikrotubulistabilitet vid fysiologiska och patologiska tillstånd.
Mikrotubuli (MT) är långsträckta rörformiga strukturer som består av protofilament bestående av α/β-tubulinheterodimerunderenheter. De spelar viktiga roller i olika cellulära processer såsom celldelning, motilitet, formunderhåll och intracellulär transport, vilket gör dem till integrerade komponenter i det eukaryota cytoskelettet1. Minus-änden av MTs, där α-tubulin-subenheten är exponerad, är relativt stabil, medan plus-end, där β-tubulin-subenheten är exponerad, genomgår dynamisk depolymerisation och polymerisation2. Denna kontinuerliga cykel av tubulindimertillsats och dissociation i plusänden, kallad dynamisk instabilitet, resulterar i en repetitiv räddnings- och katastrofprocess3. MT:er uppvisar fokala domäner med lokaliserade variationer i dynamisk instabilitet, inklusive stabila och labila domäner4.
Exakt kontroll av den dynamiska instabiliteten hos MT är avgörande för många cellulära funktioner, särskilt i neuroner som kännetecknas av intrikata morfologier. MT:s anpassningsförmåga och hållbarhet spelar en viktig roll för nervcellernas utveckling och funktion 5,6,7. Den dynamiska instabiliteten hos MT har visat sig vara associerad med olika posttranslationella modifieringar (PTM) av tubulin, såsom acetylering, fosforylering, palmitoylering, detyrosinering, delta 2, polyglutaminoxidation och polyglylyylering. Dessutom fungerar bindningen av mikrotubuliassocierade proteiner (MAP) som en regleringsmekanism8. PTM, med undantag för acetylering, förekommer främst i den tubulinkarboxiterminala regionen som är belägen på den yttre ytan av MT. Dessa modifieringar skapar olika ytförhållanden på MT:er, vilket påverkar deras interaktion med MAPs och i slutändan styr MT-stabiliteten9. Förekomsten av en karboxiterminal tyrosinrest i α-tubulin tyder på dynamiska MTs, som snabbt ersätts av den fria tubulinpoolen. Omvänt innebär detyronisering av karboxiterminalen och acetylering av Lys40 stabila MT med minskad dynamisk instabilitet 9,10.
PTM av tubulin har använts i stor utsträckning i experiment för att bedöma dynamiken och stabiliteten hos MTs 5,7,11,12,13,14,15. Till exempel, i cellodlingsstudier, kan tubuliner delas upp i två pooler: den fria tubuliinpoolen och MT-poolen. Detta uppnås genom att frigöra fritt tubulin genom cellpermeabilisering innan de återstående MT fixeras 15,16,17,18,19. Biokemiska metoder innebär användning av kemiska MT-stabilisatorer som skyddar MT från katastrof, vilket möjliggör separation av MT och fritt tubulin genom centrifugering20,21,22. Dessa procedurer skiljer dock inte mellan stabila och mindre stabila (labila) MTs, vilket gör det omöjligt att kvantifiera MTs eller lösligt tubulin i vävnader som hjärnan. Följaktligen har det visat sig vara en utmaning att utvärdera MT-stabilitet hos organismer under fysiologiska och patologiska förhållanden. För att ta itu med denna experimentella begränsning har vi utvecklat en ny teknik för att exakt separera MT och fritt tubulin i musvävnad23.
Denna unika MT-fraktioneringsmetod involverar vävnadshomogenisering under förhållanden som bibehåller tubulinstatus i vävnader och tvåstegscentrifugering för att separera stabila MTs, labila MTs och fritt tubulin. Denna enkla procedur kan tillämpas på breda studier, inklusive grundforskning om MT och MAPs i levande organismer, fysiologiska och patologiska analyser av hälsa och sjukdomar som är förknippade med MT-stabilitet, och utveckling av läkemedel och andra terapier som riktar sig mot MT.
Den viktigaste uppgiften när man undersöker statusen för tubulin i vävnad från levande organismer är att förhindra oavsiktlig MT-polymerisation eller depolymerisation under beredningen. Stabiliteten hos MT i prover påverkas av faktorer som koncentrationen av Taxol i MSB, andelen vävnadsmängd i buffert och temperatur under processen från vävnadsavlägsnande till homogenisering och centrifugering. Därför optimerades förhållandena i varje steg av protokollet för analys av musvävnad med en 20-faldig volym h…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av JST, inrättandet av universitetsstipendier för att skapa vetenskap, teknik, innovation (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), ett bidrag till vetenskaplig forskning (B) JSPS KAKENHI (22H02946 för TM), ett bidrag till vetenskaplig forskning inom innovativa områden med titeln “Brain Protein Aging and Dementia Control” från MEXT (TM; 26117004), och av Uehara Research Fellowship från Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Författarna redovisar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
AKTA prime plus | Cytiva | ||
anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |