Mikrotubuli, som er tubulinpolymerer, spiller en afgørende rolle som cytoskeletkomponent i eukaryote celler og er kendt for deres dynamiske ustabilitet. Denne undersøgelse udviklede en metode til fraktionering af mikrotubuli for at adskille dem i stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og frit tubulin for at evaluere stabiliteten af mikrotubuli i forskellige musevæv.
Mikrotubuli, der består af α/β-tubulindimerer, er en afgørende komponent i cytoskelettet i eukaryote celler. Disse rørlignende polymerer udviser dynamisk ustabilitet, da tubulinheterodimerunderenheder gennemgår gentagen polymerisation og depolymerisering. Præcis kontrol af mikrotubulus stabilitet og dynamik, opnået gennem tubulin posttranslationelle modifikationer og mikrotubulus-associerede proteiner, er afgørende for forskellige cellulære funktioner. Dysfunktioner i mikrotubuli er stærkt impliceret i patogenese, herunder neurodegenerative lidelser. Igangværende forskning fokuserer på mikrotubuli-målrettede terapeutiske midler, der modulerer stabilitet, hvilket tilbyder potentielle behandlingsmuligheder for disse sygdomme og kræftformer. Derfor er forståelse af mikrotubulis dynamiske tilstand afgørende for vurdering af sygdomsprogression og terapeutiske virkninger.
Traditionelt er mikrotubulusdynamikken blevet vurderet in vitro eller i dyrkede celler gennem grov fraktionering eller immunoassay ved hjælp af antistoffer rettet mod posttranslationelle modifikationer af tubulin. Imidlertid udgør en nøjagtig analyse af tubulinstatus i væv ved hjælp af sådanne procedurer udfordringer. I denne undersøgelse udviklede vi en enkel og innovativ mikrotubulusfraktioneringsmetode til at adskille stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og frit tubulin i musevæv.
Proceduren involverede homogenisering af dissekeret musevæv i en mikrotubulusstabiliserende buffer i et volumenforhold på 19:1. Homogenaterne blev derefter fraktioneret gennem en to-trins ultracentrifugeringsproces efter indledende langsom centrifugering (2.400 × g) for at fjerne snavs. Det første ultracentrifugeringstrin (100.000 × g) udfældede stabile mikrotubuli, mens den resulterende supernatant blev underkastet et andet ultracentrifugeringstrin (500.000 × g) for at fraktionere labile mikrotubuli og opløselige tubulindimerer. Denne metode bestemte proportionerne af tubulin, der udgør stabile eller labile mikrotubuli i musehjernen. Derudover blev der observeret forskellige vævsvariationer i mikrotubulusstabilitet, der korrelerede med de cellers proliferative kapacitet. Disse resultater fremhæver det betydelige potentiale i denne nye metode til analyse af mikrotubulusstabilitet under fysiologiske og patologiske tilstande.
Mikrotubuli (MT’er) er aflange rørformede strukturer bestående af protofilamenter bestående af α/β-tubulin heterodimerunderenheder. De spiller væsentlige roller i forskellige cellulære processer såsom celledeling, motilitet, formvedligeholdelse og intracellulær transport, hvilket gør dem til integrerede komponenter i det eukaryote cytoskelet1. Minus-enden af MT’er, hvor α-tubulin-underenheden eksponeres, er relativt stabil, mens plus-enden, hvor β-tubulin-underenheden eksponeres, gennemgår dynamisk depolymerisering og polymerisering2. Denne kontinuerlige cyklus af tubulindimertilsætning og dissociation i plus-enden, kaldet dynamisk ustabilitet, resulterer i en gentagen proces med redning og katastrofe3. MT’er udviser fokusdomæner med lokaliserede variationer i dynamisk ustabilitet, herunder stabile og labile domæner4.
Præcis kontrol af den dynamiske ustabilitet af MT’er er afgørende for adskillige cellulære funktioner, især i neuroner karakteriseret ved indviklede morfologier. MT’ernes tilpasningsevne og holdbarhed spiller en afgørende rolle for nervecellernes udvikling og korrekte funktion 5,6,7. Den dynamiske ustabilitet af MT’er har vist sig at være forbundet med forskellige posttranslationelle modifikationer (PTM’er) af tubulin, såsom acetylering, phosphorylering, palmitoylering, detyrosinering, delta 2, polyglutaminoxidation og polyglycylering. Derudover tjener bindingen af mikrotubulusassocierede proteiner (MAP’er) som en reguleringsmekanisme8. PTM’er, bortset fra acetylering, forekommer overvejende i det tubulincarboxyterminale område beliggende på den ydre overflade af MT’er. Disse ændringer skaber forskellige overfladeforhold på MT’er, påvirker deres interaktion med MAP’er og styrer i sidste ende MT-stabilitet9. Tilstedeværelsen af en carboxyterminal tyrosinrest i α-tubulin er tegn på dynamiske MT’er, som hurtigt erstattes af den frie tubulinpulje. Omvendt betyder detyrosinering af carboxyterminalen og acetylering af Lys40 stabile MT’er med reduceret dynamisk ustabilitet 9,10.
PTM’erne af tubulin er blevet anvendt i vid udstrækning i eksperimenter til at vurdere dynamikken og stabiliteten af MT’er 5,7,11,12,13,14,15. For eksempel kan tubuliner i cellekulturundersøgelser adskilles i to puljer: den frie tubulinpool og MT-poolen. Dette opnås ved at frigive frit tubulin gennem cellepermeabilisering, før de resterende MT’er fikseres 15,16,17,18,19. Biokemiske metoder involverer anvendelse af kemiske MT-stabilisatorer, der beskytter MT’er mod katastrofe, hvilket muliggør adskillelse af MT’er og frit tubulin gennem centrifugering20,21,22. Disse procedurer skelner imidlertid ikke mellem stabile og mindre stabile (labile) MT’er, hvilket gør det umuligt at kvantificere MT’er eller opløseligt tubulin i væv som hjernen. Derfor har evaluering af MT-stabilitet i organismer under fysiologiske og patologiske forhold vist sig at være udfordrende. For at imødegå denne eksperimentelle begrænsning har vi udviklet en ny teknik til præcis adskillelse af MT’er og frit tubulin i musevæv23.
Denne unikke MT-fraktioneringsmetode involverer vævshomogenisering under betingelser, der opretholder tubulinstatus i væv og totrinscentrifugering for at adskille stabile MT’er, labile MT’er og frit tubulin. Denne enkle procedure kan anvendes til brede undersøgelser, herunder grundforskning i MT’er og MAP’er i levende organismer, fysiologiske og patologiske analyser af sundhed og sygdomme forbundet med MT-stabilitet og udvikling af lægemidler og andre terapeutiske midler, der er målrettet mod MT’er.
Den vigtigste opgave ved undersøgelse af tubulins status i væv fra levende organismer er at forhindre utilsigtet MT-polymerisation eller depolymerisering under fremstillingen. Stabiliteten af MT’er i prøver påvirkes af faktorer som koncentrationen af Taxol i MSB, andelen af vævsmængde til buffer og temperatur under processen fra vævsfjernelse til homogenisering og centrifugering. Derfor blev betingelserne optimeret i hvert trin i protokollen til analyse af musevæv med et 20 gange volumen homogenat. En højere kon…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvis støttet af JST, oprettelsen af universitetsstipendier med henblik på skabelse af videnskabelig teknologisk innovation (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), et Grant-in-Aid for Scientific Research (B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), et Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas med titlen “Brain Protein Aging and Dementia Control” fra MEXT (TM; 26117004) og af Uehara Research Fellowship fra Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
AKTA prime plus | Cytiva | ||
anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |