माउस ऊतकों में स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं, लैबिल माइक्रोट्यूबुल्स और मुक्त ट्यूबुलिन को अलग करने के लिए मात्रात्मक सूक्ष्मनलिका विभाजन तकनीक
Summary
माइक्रोट्यूबुल्स, जो ट्यूबुलिन पॉलिमर हैं, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में साइटोस्केलेटन घटक के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और उनकी गतिशील अस्थिरता के लिए जाने जाते हैं। इस अध्ययन ने विभिन्न माउस ऊतकों में सूक्ष्मनलिकाएं की स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए उन्हें स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं, लेबिल सूक्ष्मनलिकाएं और मुक्त ट्यूबुलिन में अलग करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं अलग करने के लिए एक विधि विकसित की।
Abstract
α β-ट्यूबुलिन डिमर से बने सूक्ष्मनलिकाएं, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में साइटोस्केलेटन का एक महत्वपूर्ण घटक हैं। ये ट्यूब जैसे पॉलिमर गतिशील अस्थिरता प्रदर्शित करते हैं क्योंकि ट्यूबुलिन हेटेरोडिमर सबयूनिट्स दोहराए जाने वाले पोलीमराइजेशन और डिपोलीमराइजेशन से गुजरते हैं। ट्यूबुलिन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन के माध्यम से प्राप्त सूक्ष्मनलिका स्थिरता और गतिशीलता का सटीक नियंत्रण, विभिन्न सेलुलर कार्यों के लिए आवश्यक है। सूक्ष्मनलिकाएं में शिथिलता को रोगजनन में दृढ़ता से फंसाया जाता है, जिसमें न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार शामिल हैं। चल रहे शोध सूक्ष्मनलिका-लक्ष्यीकरण चिकित्सीय एजेंटों पर केंद्रित हैं जो स्थिरता को संशोधित करते हैं, इन बीमारियों और कैंसर के लिए संभावित उपचार विकल्प प्रदान करते हैं। नतीजतन, सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशील स्थिति को समझना रोग की प्रगति और चिकित्सीय प्रभावों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
परंपरागत रूप से, सूक्ष्मनलिका की गतिशीलता का मूल्यांकन विट्रो या सुसंस्कृत कोशिकाओं में रफ फ्रैक्शनेशन या इम्यूनोएसे के माध्यम से किया गया है, जिसमें ट्यूबुलिन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग किया गया है। हालांकि, ऐसी प्रक्रियाओं का उपयोग करके ऊतकों में ट्यूबुलिन की स्थिति का सटीक विश्लेषण करना चुनौतियों का सामना करता है। इस अध्ययन में, हमने माउस ऊतकों में स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं, लेबिल सूक्ष्मनलिकाएं और मुक्त ट्यूबुलिन को अलग करने के लिए एक सरल और अभिनव सूक्ष्मनलिका विभाजन विधि विकसित की।
इस प्रक्रिया में 19: 1 वॉल्यूम अनुपात पर सूक्ष्मनलिका-स्थिर बफर में विच्छेदित माउस ऊतकों को होमोजेनाइज करना शामिल था। मलबे को हटाने के लिए प्रारंभिक धीमी सेंट्रीफ्यूजेशन (2,400 × ग्राम) के बाद दो-चरण अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया के माध्यम से होमोजेनेट्स को अलग किया गया था। पहले अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण (100,000 × ग्राम) ने स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं अवक्षेपित कीं, जबकि परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला को दूसरे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण (500,000 × ग्राम) के अधीन किया गया ताकि लेबिल सूक्ष्मनलिकाएं और घुलनशील ट्यूबुलिन डिमर को अलग किया जा सके। इस विधि ने माउस मस्तिष्क में स्थिर या लेबिल सूक्ष्मनलिकाएं बनाने वाले ट्यूबुलिन के अनुपात को निर्धारित किया। इसके अतिरिक्त, सूक्ष्मनलिका स्थिरता में अलग-अलग ऊतक भिन्नताएं देखी गईं जो घटक कोशिकाओं की प्रोलिफेरेटिव क्षमता के साथ सहसंबद्ध थीं। ये निष्कर्ष शारीरिक और रोग स्थितियों में सूक्ष्मनलिका स्थिरता का विश्लेषण करने के लिए इस नई विधि की महत्वपूर्ण क्षमता को उजागर करते हैं।
Introduction
सूक्ष्मनलिकाएं (एमटी) लम्बी ट्यूबलर संरचनाएं हैं जिनमें α/β-ट्यूबुलिन हेटेरोडिमर सबयूनिट्स से युक्त प्रोटोफिलामेंट्स शामिल हैं। वे विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे कोशिका विभाजन, गतिशीलता, आकार रखरखाव और इंट्रासेल्युलर परिवहन में आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिससे वे यूकेरियोटिक साइटोस्केलेटन1 के अभिन्न घटक बन जाते हैं। एमटी का माइनस-एंड, जहां α-ट्यूबुलिन सबयूनिट उजागर होता है, अपेक्षाकृत स्थिर होता है, जबकि प्लस-एंड, जहां β-ट्यूबुलिन सबयूनिट उजागर होता है, गतिशील डीपोलीमराइजेशन और पोलीमराइजेशन2 से गुजरता है। प्लस-एंड पर ट्यूबुलिन डिमर जोड़ और पृथक्करण का यह निरंतर चक्र, जिसे गतिशील अस्थिरता के रूप में जाना जाता है, के परिणामस्वरूप बचाव और तबाही की दोहराव वाली प्रक्रिया होतीहै। एमटी गतिशील अस्थिरता में स्थानीयकृत विविधताओं के साथ फोकल डोमेन प्रदर्शित करते हैं, जिसमें स्थिर और लेबिल डोमेनशामिल हैं।
एमटी की गतिशील अस्थिरता का सटीक नियंत्रण कई सेलुलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से जटिल आकृति विज्ञान की विशेषता वाले न्यूरॉन्स में। एमटी की अनुकूलनशीलता और स्थायित्वतंत्रिका कोशिकाओं के विकास और उचित कार्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एमटी की गतिशील अस्थिरता ट्यूबुलिन के विभिन्न पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) से जुड़ी हुई पाई गई है, जैसे कि एसिटिलीकरण, फॉस्फोराइलेशन, पामिटोनाइलेशन, डिटायरोसिनेशन, डेल्टा 2, पॉलीग्लूटामाइन ऑक्सीकरण, और पॉलीग्लाइसिलेशन। इसके अतिरिक्त, सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन (एमएपी) का बंधन एक नियामक तंत्र8 के रूप में कार्य करता है। एसिटिलीकरण को छोड़कर पीटीएम, मुख्य रूप से एमटी की बाहरी सतह पर स्थित ट्यूबुलिन कार्बोक्सी-टर्मिनल क्षेत्र में होते हैं। ये संशोधन एमटी पर विविध सतह की स्थिति बनाते हैं, एमएपी के साथ उनकी बातचीत को प्रभावित करते हैं और अंततः एमटी स्थिरताको नियंत्रित करते हैं। α-ट्यूबुलिन में कार्बोक्सी-टर्मिनल टायरोसिन अवशेष की उपस्थिति गतिशील एमटी का संकेत है, जो तेजी से मुक्त ट्यूबुलिन पूल द्वारा प्रतिस्थापित की जाती है। इसके विपरीत, कार्बोक्सी टर्मिनस का विघटन और लिस 40 का एसिटिलीकरण कम गतिशील अस्थिरता 9,10 के साथ स्थिर एमटी का संकेत देता है।
ट्यूबुलिन के पीटीएम को एमटी 5,7,11,12,13,14,15 की गतिशीलता और स्थिरता का आकलन करने के लिए प्रयोगों में बड़े पैमाने पर नियोजित किया गया है। उदाहरण के लिए, सेल कल्चर अध्ययन में, ट्यूबुलिन को दो पूलों में अलग किया जा सकता है: मुक्त ट्यूबुलिन पूल और एमटी पूल। यह शेष एमटी15,16,17,18,19 को ठीक करने से पहले सेल परमेबिलाइजेशन के माध्यम से मुक्त ट्यूबुलिन जारी करके प्राप्त किया जाता है। जैव रासायनिक विधियों में रासायनिक एमटी स्टेबलाइजर्स का उपयोग शामिल है जो एमटी को तबाही से बचाता है, सेंट्रीफ्यूजेशन20,21,22 के माध्यम से एमटी और मुक्त ट्यूबुलिन को अलग करने में सक्षम बनाता है। हालांकि, ये प्रक्रियाएं स्थिर और कम स्थिर (लेबिल) एमटी के बीच अंतर नहीं करती हैं, जिससे मस्तिष्क जैसे ऊतकों में एमटी या घुलनशील ट्यूबुलिन की मात्रा निर्धारित करना असंभव हो जाता है। नतीजतन, शारीरिक और रोग स्थितियों के तहत जीवों में एमटी स्थिरता का मूल्यांकन चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। इस प्रयोगात्मक सीमा को संबोधित करने के लिए, हमने माउस ऊतक23 में एमटी और मुक्त ट्यूबुलिन को ठीक से अलग करने के लिए एक नई तकनीक विकसित की है।
इस अद्वितीय एमटी फ्रैक्शनेशन विधि में ऊतकों में ट्यूबुलिन की स्थिति बनाए रखने वाली स्थितियों के तहत ऊतक समरूपीकरण और स्थिर एमटी, लेबिल एमटी और मुक्त ट्यूबुलिन को अलग करने के लिए दो-चरण सेंट्रीफ्यूजेशन शामिल है। इस सरल प्रक्रिया को व्यापक अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें जीवित जीवों में एमटी और एमएपी पर बुनियादी शोध, एमटी स्थिरता से जुड़े स्वास्थ्य और बीमारियों के शारीरिक और पैथोलॉजिकल विश्लेषण, और एमटी को लक्षित करने वाली दवाओं और अन्य चिकित्सीय दवाओं को विकसित करना शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीवित जीवों से ऊतक में ट्यूबुलिन की स्थिति की जांच करते समय सबसे महत्वपूर्ण कार्य तैयारी के दौरान आकस्मिक एमटी पोलीमराइजेशन या डीपोलीमराइजेशन को रोकना है। नमूनों में एमटी की स्थिरता एमएसबी में टैक्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जेएसटी द्वारा विज्ञान प्रौद्योगिकी नवाचार (A.HT) के निर्माण की दिशा में विश्वविद्यालय फैलोशिप की स्थापना द्वारा समर्थित किया गया था; JPMJFS2145), जेएसटी स्प्रिंग (A.HT); JPMJSP2129), जेएसपीएस अध्येताओं के लिए सहायता अनुदान (A.HT; 23केजे2078), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (बी) जेएसपीएस काकेन्ही (टीएम के लिए 22एच02946), एमईएक्सटी (टीएम; 26117004) से “ब्रेन प्रोटीन एजिंग एंड डिमेंशिया कंट्रोल” नामक अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान, और यूहारा मेमोरियल फाउंडेशन (टीएम; 202020027) से यूहारा रिसर्च फैलोशिप। लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।
Materials
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| AKTA prime plus | Cytiva | ||
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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