Выделение мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани крыс для дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки
Summary
Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (Ad-MSC), могут быть потенциальным источником МСК, которые дифференцируются в инсулин-продуцирующие клетки (IPC). В этом протоколе мы предоставляем подробные шаги для выделения и характеристики ad-MSC придатка яичка крыс, за которым следует простой, короткий протокол для генерации IPC из тех же крыс Ad-MSC.
Abstract
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), особенно те, которые выделены из жировой ткани (Ad-MSC), привлекли особое внимание как возобновляемый, обильный источник стволовых клеток, который не представляет никаких этических проблем. Однако современные методы изоляции Ad-MSC не стандартизированы и используют сложные протоколы, требующие специального оборудования. Мы выделили Ad-MSC из эпидидимального жира крыс Sprague-Dawley, используя простой, воспроизводимый метод. Изолированные Ad-MSC обычно появляются в течение 3 дней после изоляции, так как адгезивные клетки демонстрируют фибробластную морфологию. Эти клетки достигают 80% слияния в течение 1 недели после изоляции. Затем, при прохождении 3-5 (P3-5), была проведена полная характеристика для изолированных Ad-МСК путем иммунофенотипирования для характерного кластера MSC поверхностных маркеров дифференцировки (CD), таких как CD90, CD73 и CD105, а также индуцирование дифференцировки этих клеток вниз по остеогенным, адипогенным и хондрогенным линиям. Это, в свою очередь, подразумевает мультипотентность изолированных клеток. Кроме того, мы индуцировали дифференцировку изолированных Ad-MSC в сторону линии инсулин-продуцирующих клеток (IPC) с помощью простого, относительно короткого протокола путем включения модифицированной среды Eagle с высоким содержанием глюкозы Dulbecco (HG-DMEM), β-меркаптоэтанола, никотинамида и эксендина-4. Дифференцировка IPC оценивалась генетически, во-первых, путем измерения уровней экспрессии специфических β-клеточных маркеров, таких как MafA, NKX6.1, Pdx-1 и Ins1, а также окрашивания дитизоном для генерируемых IPC. Во-вторых, оценка также проводилась функционально с помощью глюкозо-стимулированной секреции инсулина (GSIS). В заключение, Ad-MSC могут быть легко изолированы, демонстрируя все критерии характеристики MSC, и они действительно могут обеспечить обильный, возобновляемый источник IPC в лаборатории для исследований диабета.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), также известные как мезенхимальные стромальные клетки, являются одними из наиболее широко используемых типов клеток для регенеративной медицины 1,2. Они классифицируются как взрослые стволовые клетки и характеризуются многолинейным дифференцирующим потенциалом и способностью к самообновлению3. МСК могут быть выделены и получены из различных источников, включая жировую ткань, костный мозг, периферическую кровь, пуповинную ткань и кровь, волосяные фолликулы и зубы 4,5.
Выделение стволовых клеток из жировой ткани рассматривается как привлекательное и перспективное из-за их легкого доступа, быстрого расширения in vitro и высокого выхода6. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (Ad-MSC), могут быть выделены из различных видов, таких как люди, коровы, мыши, крысы и, в последнее время, козы7. Было доказано, что Ad-MSC в настоящее время являются потенциальными кандидатами на тканевую инженерию и генно-клеточную терапию, которые могут быть даже использованы для разработки аутологичной альтернативы для долгосрочного восстановления повреждения мягких тканей или дефектов 7,8.
Международное общество клеточной и генной терапии (ISCT) определило три минимальных критерия, которые должны быть выставлены МСК для полной характеристики9. Во-первых, они должны быть пластиковыми. Во-вторых, МСК должны экспрессировать поверхностные маркеры мезенхимальных стволовых клеток, такие как CD73, CD90 и CD105, и не иметь экспрессии гемопоэтических маркеров CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79α или CD19 и HLA-DR. Наконец, МСК должны проявлять способность дифференцироваться в три мезенхимальные линии: адипоциты, остеоциты и хондроциты. Интересно, что МСК могут также дифференцироваться в другие линии, такие как нейронные клетки, кардиомиоциты, гепатоциты и эпителиальные клетки10,11.
Фактически, МСК обладают уникальными свойствами, которые позволяют применять их в качестве потенциальных терапевтических средств в регенеративной терапии различных заболеваний. МСК могут секретировать растворимые факторы, чтобы индуцировать иммуномодулирующую среду, которая обеспечивает терапевтические преимущества12. Кроме того, МСК могут мигрировать в места повреждения и микроокружения опухоли для проведения таргетной терапии; однако механизмы не полностью выяснены13. Кроме того, МСК обладают способностью секретировать экзосомы, внеклеточные везикулы в наномасштабе, которые несут груз некодирующих РНК, белка и растворимых факторов, которые в последнее время появились как новый механизм терапевтического потенциала МСК при различных заболеваниях14.
Что еще более важно, МСК привлекли заметное внимание к их способности дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки (IPC) либо путем генетической модификации 15,16, либо путем использования различных внешних индуцирующих факторов в культуральной среде in vitro17. Период индукции IPC сильно варьируется, так как он зависит от используемого протокола индукции и используемых внешних факторов. Процесс дифференцировки может длиться от нескольких дней до месяцев, и он требует комбинации экзогенно-индуцирующих факторов, которые должны быть добавлены и / или выведены на разных стадиях. Многие из этих факторов, которые использовались для эндокринной дифференцировки поджелудочной железы, являются биологически активными соединениями, которые, как было показано, способствуют пролиферации или дифференцировке/неогенезу инсулин-секретирующих β-клеток и/или увеличивают содержание инсулина в IPC 18,19,20,21. Здесь также примечательно, что МСК также, как сообщается, оказывают терапевтическое действие при диабете и его осложнениях через несколько механизмов, включая их секретом, а также широкий спектр иммуномодулирующих действий 22,23,24.
В этом протоколе мы представляем подробный пошаговый протокол для выделения и характеристики Ad-MSC из эпидидимального жира крыс, за которым следует простой, относительно короткий протокол для генерации IPC из Ad-MSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе нам удалось представить подробный протокол для выделения Ad-MSC из эпидидимального жира крыс и дифференциации этих Ad-MSC в IPC. Фактически, эпидимидмальный жир крысы является легкодоступным источником жировой ткани для получения Ad-MSC и не требует какого-либо специального об…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Равду Самир Мохамед, магистратуру, ветеринарного специалиста фармацевтического факультета Британского университета Египта (BUE) за помощь в рассечении крыс.
Мы также хотели бы отметить и оценить усилия факультета массовых коммуникаций Британского университета в Египте (BUE) по производству и редактированию видео этой рукописи.
Мы хотели бы поблагодарить мисс Фатму Масуд, магистратуру, ассистента преподавателя английского языка, Британский университет в Египте (BUE) за пересмотр и вычитку рукописи на английском языке.
Эта работа была частично профинансирована Центром исследований и разработок лекарств (CDRD), фармацевтическим факультетом Британского университета в Египте (BUE), Каир, Египет.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton’s jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton’s jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
