Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes von Ratten zur Differenzierung in insulinproduzierende Zellen
Summary
Aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (Ad-MSCs) können eine potenzielle Quelle für MSCs sein, die sich in insulinproduzierende Zellen (IPCs) differenzieren. In diesem Protokoll stellen wir detaillierte Schritte zur Isolierung und Charakterisierung von epididymalen Ad-MSCs von Ratten bereit, gefolgt von einem einfachen, kurzen Protokoll zur Generierung von IPCs aus denselben Ratten-Ad-MSCs.
Abstract
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) – insbesondere solche, die aus Fettgewebe isoliert wurden (Ad-MSCs) – haben als erneuerbare, reichlich vorhandene Quelle von Stammzellen, die keine ethischen Bedenken aufwirft, besondere Aufmerksamkeit erregt. Die derzeitigen Methoden zur Isolierung von Ad-MSCs sind jedoch nicht standardisiert und verwenden komplizierte Protokolle, die eine spezielle Ausrüstung erfordern. Wir isolierten Ad-MSCs aus dem Nebenhodenfett von Sprague-Dawley-Ratten mit einer einfachen, reproduzierbaren Methode. Die isolierten Ad-MSCs erscheinen normalerweise innerhalb von 3 Tagen nach der Isolierung, da adhärente Zellen eine fibroblastische Morphologie aufweisen. Diese Zellen erreichen innerhalb von 1 Woche nach der Isolierung eine Konfluenz von 80%. Danach, in der Passage 3-5 (P3-5), wurde eine vollständige Charakterisierung für die isolierten Ad-MSCs durch Immunphänotypisierung für charakteristische MSC-Cluster-of-Differentiation-Oberflächenmarker (CD) wie CD90, CD73 und CD105 sowie durch Induktion der Differenzierung dieser Zellen entlang der osteogenen, adipogenen und chondrogenen Linien durchgeführt. Dies wiederum impliziert die Multipotenz der isolierten Zellen. Darüber hinaus induzierten wir die Differenzierung der isolierten Ad-MSCs in Richtung der insulinproduzierenden Zellen (IPCs) über ein einfaches, relativ kurzes Protokoll, indem wir das modifizierte Eagle-Medium (HG-DMEM), β-Mercaptethanol, Nicotinamid und Exendin-4 von Dulbecco mit hoher Glucose einbehielten. Die IPC-Differenzierung wurde genetisch bewertet, indem zunächst die Expressionsniveaus spezifischer β-Zell-Marker wie MafA, NKX6.1, Pdx-1 und Ins1 sowie die Dithizon-Färbung für die erzeugten IPCs gemessen wurden. Zweitens wurde die Bewertung auch funktionell durch einen Glukose-stimulierten Insulinsekretions-Assay (GSIS) durchgeführt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Ad-MSCs leicht isoliert werden können, indem sie alle MSC-Charakterisierungskriterien aufweisen, und sie können in der Tat eine reichliche, erneuerbare Quelle von IPCs im Labor für die Diabetesforschung bieten.
Introduction
Mesenchymale Stammzellen (MSCs), auch mesenchymale Stromazellen genannt, gehören zu den am häufigsten verwendeten Zelltypen für die regenerative Medizin 1,2. Sie werden als adulte Stammzellen klassifiziert und zeichnen sich durch Multilineage-Differenzierungspotenzial und Selbsterneuerungskapazitätaus 3. MSCs können isoliert und aus verschiedenen Quellen gewonnen werden, einschließlich Fettgewebe, Knochenmark, peripherem Blut, Nabelschnurgewebe und Blut, Haarfollikeln und Zähnen 4,5.
Die Isolierung von Stammzellen aus Fettgewebe wird aufgrund ihres einfachen Zugangs, ihrer schnellen Expansion in vitro und ihrer hohen Ausbeute als attraktiv und vielversprechend angesehen6. Aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (Ad-MSCs) können aus verschiedenen Arten wie Menschen, Rindern, Mäusen, Ratten und in jüngster Zeit auch aus Ziegenisoliert werden 7. Es wurde nachgewiesen, dass Ad-MSCs jetzt potenzielle Kandidaten für Tissue Engineering und Gen-/Zelltherapie sind, die sogar verwendet werden können, um eine autologe Alternative für die langfristige Reparatur von Weichteilverletzungen oder -defekten zu entwickeln 7,8.
Die International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) hat drei Mindestkriterien definiert, die von MSCs für eine vollständige Charakterisierung nachgewiesen werden müssen9. Erstens müssen sie plastikhaltig sein. Zweitens sollten MSCs mesenchymale Stammzelloberflächenmarker wie CD73, CD90 und CD105 exprimieren und die hämatopoetischen Marker CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79α oder CD19 und HLA-DR nicht exprimieren. Schließlich sollten MSCs die Fähigkeit aufweisen, sich in die drei mesenchymalen Linien zu differenzieren: Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten. Interessanterweise können MSCs auch in andere Linien wie neuronale Zellen, Kardiomyozyten, Hepatozyten und Epithelzellendifferenzieren 10,11.
Tatsächlich besitzen MSCs einzigartige Eigenschaften, die es ermöglichen, sie als potenzielle Therapeutika in der regenerativen Therapie für verschiedene Krankheiten einzusetzen. MSCs können lösliche Faktoren absondern, um eine immunmodulatorische Umgebung zu induzieren, die therapeutische Vorteile bietet12. Darüber hinaus können MSCs zu Verletzungsstellen und Tumormikroumgebungen migrieren, um eine zielgerichtete Therapie durchzuführen. Die Mechanismen sind jedoch nicht vollständig aufgeklärt13. Darüber hinaus haben MSCs die Fähigkeit, Exosomen abzusondern, extrazelluläre Vesikel im Nanobereich, die eine Ladung nicht-kodierender RNAs, Proteine und löslicher Faktoren tragen, die sich in letzter Zeit als neuartiger Mechanismus des therapeutischen Potenzials der MSCs bei verschiedenen Krankheiten herausgestellthaben 14.
Noch wichtiger ist, dass MSCs deutliche Aufmerksamkeit für ihr Potenzial zur Differenzierung in insulinproduzierende Zellen (IPCs) erzeugt haben, entweder durch genetische Veränderung 15,16 oder durch die Verwendung verschiedener extrinsisch induzierender Faktoren innerhalb der Kulturmedien in vitro17. Die IPC-Induktionsperiode variiert stark, da sie vom verwendeten Induktionsprotokoll und den verwendeten extrinsischen Faktoren abhängt. Der Prozess der Differenzierung kann von Tagen bis zu Monaten dauern und erfordert eine Kombination von exogen induzierenden Faktoren, die in verschiedenen Stadien hinzugefügt und / oder zurückgezogen werden müssen. Viele dieser Faktoren, die für die endokrine Pankreasdifferenzierung verwendet wurden, sind biologisch aktive Verbindungen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Proliferation oder Differenzierung / Neogenese von insulinsezernierenden β-Zellen fördern und / oder den Insulingehalt von IPCs 18,19,20,21 erhöhen. Es ist hier bemerkenswert, dass MSCs auch therapeutische Wirkungen bei Diabetes und seinen Komplikationen über mehrere Mechanismen, einschließlich ihres Sekrets, sowie eine breite Palette von immunmodulatorischen Wirkungen haben22,23,24.
In diesem Protokoll stellen wir ein detailliertes Stufenprotokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Ad-MSCs aus Eileiterfett von Ratten vor, gefolgt von einem einfachen, relativ kurzen Protokoll zur Generierung von IPCs aus Ad-MSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll ist es uns gelungen, ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Ad-MSCs aus Ratten-Nebenhodenfett und die Differenzierung dieser Ad-MSCs in IPCs vorzustellen. Tatsächlich ist das epidydimale Fett der Ratte eine leicht zugängliche Quelle von Fettgewebe zur Gewinnung von Ad-MSCs und erfordert keine spezielle Ausrüstung, weder für die Sammlung noch für die Verarbeitung 15,26,27. Die isolierten Ad-M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Tierarzt, Fakultät für Pharmazie, The British University of Egypt (BUE) für die Hilfe bei der Sezierung der Ratten.
Wir möchten auch die Bemühungen der Fakultät für Massenkommunikation der British University in Egypt (BUE) für die Produktion und Bearbeitung des Videos dieses Manuskripts anerkennen und schätzen.
Wir danken Miss Fatma Masoud, MSc, Assistant Lecturer of English, The British University in Egypt (BUE) für die Überarbeitung und das Korrekturlesen des Manuskripts in englischer Sprache.
Diese Arbeit wurde teilweise vom Center for Drug Research and Development (CDRD), Fakultät für Pharmazie, The British University in Egypt (BUE), Kairo, Ägypten, finanziert.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
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