Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido adiposo de rata para la diferenciación en células productoras de insulina
Summary
Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-MSC) pueden ser una fuente potencial de MSC que se diferencian en células productoras de insulina (IPC). En este protocolo, proporcionamos pasos detallados para el aislamiento y la caracterización de las MSC Ad-MSC epidídimas de ratas, seguidas de un protocolo simple y corto para la generación de IPC a partir de las mismas MSC Ad-MSC de ratas.
Abstract
Las células madre mesenquimales (MSC), especialmente aquellas aisladas del tejido adiposo (MSC Ad), han ganado especial atención como una fuente renovable y abundante de células madre que no plantea ninguna preocupación ética. Sin embargo, los métodos actuales para aislar las MSC Ad no están estandarizados y emplean protocolos complicados que requieren equipos especiales. Se aislaron las MSC Ad-MSC de la grasa epidídima de las ratas Sprague-Dawley utilizando un método simple y reproducible. Las MSC Ad aisladas generalmente aparecen dentro de los 3 días posteriores al aislamiento, ya que las células adherentes muestran morfología fibroblástica. Esas células alcanzan el 80% de confluencia dentro de 1 semana de aislamiento. Posteriormente, en el paso 3-5 (P3-5), se llevó a cabo una caracterización completa para las MSC Ad-MSC aisladas mediante inmunofenotipado para marcadores de superficie característicos del grupo de diferenciación (CD) MSC como CD90, CD73 y CD105, así como inducir la diferenciación de estas células a través de los linajes osteogénico, adipogénico y condrogénico. Esto, a su vez, implica la multipotencia de las células aisladas. Además, inducimos la diferenciación de las Ad-MSC aisladas hacia el linaje de células productoras de insulina (IPC) a través de un protocolo simple y relativamente corto mediante la incorporación del medio Eagle modificado de Dulbecco de alta glucosa (HG-DMEM), β-mercaptoetanol, nicotinamida y exendina-4. La diferenciación de los IPC se evaluó genéticamente, en primer lugar, mediante la medición de los niveles de expresión de marcadores específicos de células β como MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, así como la tinción de ditizona para los IPC generados. En segundo lugar, la evaluación también se llevó a cabo funcionalmente mediante un ensayo de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). En conclusión, las MSC Ad-MSC se pueden aislar fácilmente, exhibiendo todos los criterios de caracterización de MSC, y de hecho pueden proporcionar una fuente abundante y renovable de IPC en el laboratorio para la investigación de la diabetes.
Introduction
Las células madre mesenquimales (MSC), también conocidas como células del estroma mesenquimal, se encuentran entre los tipos de células más utilizados para la medicina regenerativa 1,2. Se clasifican como células madre adultas y se caracterizan por un potencial de diferenciación multilinaje y capacidad de autorrenovación3. Las MSC se pueden aislar y obtener de diversas fuentes, incluyendo tejido adiposo, médula ósea, sangre periférica, tejido y sangre del cordón umbilical, folículos pilosos y dientes 4,5.
El aislamiento de las células madre del tejido adiposo se considera atractivo y prometedor debido a su fácil acceso, rápida expansión in vitro y alto rendimiento6. Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-MSC) se pueden aislar de diferentes especies como humanos, bovinos, ratones, ratas y, más recientemente, cabras7. Se ha demostrado que las MSC Ad son ahora candidatos potenciales para la ingeniería de tejidos y la terapia génica / celular que incluso se pueden utilizar para desarrollar una alternativa autóloga para la reparación a largo plazo de lesiones o defectos de tejidos blandos 7,8.
La Sociedad Internacional de Terapia Celular y Génica (ISCT) ha definido tres criterios mínimos que deben ser exhibidos por las MSC para la caracterización completa9. Primero, deben ser adherentes al plástico. En segundo lugar, las MSC deben expresar marcadores de superficie de células madre mesenquimales como CD73, CD90 y CD105 y carecer de expresión de los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19 y HLA-DR. Finalmente, las MSC deben exhibir la capacidad de diferenciarse en los tres linajes mesenquimales: adipocitos, osteocitos y condrocitos. Curiosamente, las MSC también pueden diferenciarse en otros linajes como células neuronales, cardiomiocitos, hepatocitos y células epiteliales10,11.
De hecho, las MSC poseen propiedades únicas que les permiten ser aplicadas como agentes terapéuticos potenciales en la terapia regenerativa para diferentes enfermedades. Las MSC pueden secretar factores solubles para inducir un ambiente inmunomodulador que proporciona beneficios terapéuticos12. Además, las MSC pueden migrar hacia sitios de lesión y microambientes tumorales para administrar terapia dirigida; sin embargo, los mecanismos no están completamente dilucidados13. Además, las MSC tienen la capacidad de secretar exosomas, vesículas extracelulares en la nanoescala que transportan una carga de ARN no codificantes, proteínas y factores solubles, que últimamente surgieron como un nuevo mecanismo del potencial terapéutico de las MSC en diversas enfermedades14.
Más importante aún, las MSC han generado una marcada atención por su potencial para diferenciarse en células productoras de insulina (IPC), ya sea por modificación genética15,16 o mediante la utilización de varios factores inductores extrínsecos dentro de los medios de cultivo in vitro17. El período de inducción de IPC varía mucho, ya que depende del protocolo de inducción utilizado y de los factores extrínsecos utilizados. El proceso de diferenciación puede durar de días a meses, y requiere una combinación de factores exógenos inductores que deben agregarse y / o retirarse en diferentes etapas. Muchos de estos factores que se han utilizado para la diferenciación pancreática endocrina son compuestos biológicamente activos que han demostrado promover la proliferación o diferenciación/neogénesis de las células β secretoras de insulina y/o aumentar el contenido de insulina de los IPC 18,19,20,21. Cabe destacar aquí que también se ha informado que las MSC tienen efectos terapéuticos en la diabetes y sus complicaciones a través de varios mecanismos, incluido su secretoma, así como una amplia gama de acciones inmunomoduladoras 22,23,24.
En este protocolo, presentamos un protocolo paso a paso detallado para el aislamiento y caracterización de Ad-MSC a partir de grasa epidídima de rata, seguido de un protocolo simple y relativamente corto para la generación de IPC a partir de Ad-MSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, logramos presentar un protocolo detallado para el aislamiento de Ad-MSCs de grasa epidídima de rata y la diferenciación de estos Ad-MSCs en IPC. De hecho, la grasa epidídima de rata es una fuente fácilmente alcanzable de tejido adiposo para la obtención de Ad-MSC y no requiere ningún equipo especial, ni para la recolección ni para el procesamiento 15,26,27. Las MSC Ad aisladas mostraron una excelente ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos al Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Especialista Veterinario, Facultad de Farmacia, Universidad Británica de Egipto (BUE) por ayudar con la disección de las ratas.
También nos gustaría reconocer y apreciar los esfuerzos de la Facultad de Comunicación de Masas, la Universidad Británica en Egipto (BUE) para la producción y edición del video de este manuscrito.
Nos gustaría agradecer a la señorita Fatma Masoud, MSc, profesora asistente de inglés, La Universidad Británica de Egipto (BUE) por la revisión y revisión en inglés del manuscrito.
Este trabajo fue parcialmente financiado por el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CDRD), Facultad de Farmacia, La Universidad Británica de Egipto (BUE), El Cairo, Egipto.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
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