Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina
Summary
Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser uma fonte potencial de MSCs que se diferenciam em células produtoras de insulina (IPCs). Neste protocolo, fornecemos passos detalhados para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs epidímicas de ratos, seguidos de um protocolo simples e curto para a geração de IPCs a partir dos mesmos Ad-MSCs de ratos.
Abstract
As células-tronco mesenquimais (MSCs)- especialmente aquelas isoladas do tecido adiposo (Ad-MSCs)-ganharam atenção especial como uma fonte renovável e abundante de células-tronco que não representam nenhuma preocupação ética. No entanto, os métodos atuais para isolar os Ad-MSCs não são padronizados e empregam protocolos complicados que requerem equipamentos especiais. Isolamos os Ad-MSCs da gordura epidídimamal dos ratos de Sprague-Dawley usando um método simples e reprodutível. Os Ad-MSCs isolados geralmente aparecem dentro de 3 dias após o isolamento, já que as células aderentes apresentam morfologia fibroblástica. Essas células atingem 80% de confluência em 1 semana de isolamento. Posteriormente, na passagem 3-5 (P3-5), foi realizada uma caracterização completa para os Ad-MSCs isolados por imunofenofoteping para aglomerados característicos de marcadores de superfície msc de diferenciação (CD), como CD90, CD73 e CD105, bem como induzir diferenciação dessas células pelas linhagenias osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. Isso, por sua vez, implica a multipotência das células isoladas. Além disso, induzimos a diferenciação dos Ad-MSCs isolados em relação à linhagem de células produtoras de insulina (IPCs) através de um protocolo simples e relativamente curto, incorporando o meio eagle modificado de alta glicose Dulbecco (HG-DMEM), β-mercaptoetanol, nicotinamida e exendin-4. A diferenciação dos IPCs foi geneticamente avaliada, em primeiro lugar, através da medição dos níveis de expressão de marcadores específicos de células β, como MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, bem como a coloração de dithizone para os IPCs gerados. Em segundo lugar, a avaliação também foi realizada funcionalmente por um ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). Em conclusão, os Ad-MSCs podem ser facilmente isolados, exibindo todos os critérios de caracterização do MSC, e eles podem de fato fornecer uma fonte abundante e renovável de IPCs no laboratório para pesquisa de diabetes.
Introduction
As células-tronco mesenquimais (MSCs), também conhecidas como células estromais mesenquimais, estão entre os tipos de células mais amplamente utilizados para a medicina regenerativa 1,2. São classificadas como células-tronco adultas e caracterizadas pelo potencial de diferenciação multilineagem e capacidade de auto-renovação3. Os MSCs podem ser isolados e obtidos de várias fontes, incluindo tecido adiposo, medula óssea, sangue periférico, tecido do cordão umbilical e sangue, folículos capilares e dentes 4,5.
O isolamento das células-tronco do tecido adiposo é visto como atraente e promissor devido ao seu fácil acesso, rápida expansão in vitro e alto rendimento6. As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser isoladas de diferentes espécies, como humanos, bovinos, ratos, ratos e, mais recentemente, cabras7. Foi comprovado que os Ad-MSCs são agora potenciais candidatos à engenharia de tecidos e terapia gene/célula que podem até ser usados para desenvolver uma alternativa autóloga para a reparação a longo prazo de lesões de tecido mole ou defeitos 7,8.
A Sociedade Internacional de Terapia Celular e Genética (ISCT) definiu três critérios mínimos que devem ser apresentados pelos MSCs para caracterização completa9. Primeiro, eles devem ser adeptos de plástico. Em segundo lugar, os MSCs devem expressar marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais como CD73, CD90 e CD105 e falta de expressão dos marcadores hematopoiéticos CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR. Finalmente, os MSCs devem exibir a capacidade de diferenciar-se nas três linhagens mesenquimais: adipócitos, osteocitos e condrócitos. Curiosamente, os MSCs também podem se diferenciar em outras linhagens, como células neuronais, cardiomiócitos, hepatócitos e células epiteliais10,11.
De fato, os MSCs possuem propriedades únicas que lhes permitem ser aplicados como potenciais agentes terapêuticos na terapia regenerativa para diferentes doenças. Os MSCs podem segregar fatores solúveis para induzir um ambiente imunomodulatório que proporciona benefícios terapêuticos12. Além disso, os MSCs podem migrar para locais de lesões e microambientes tumorais para fornecer terapia direcionada; no entanto, os mecanismos não são totalmente elucidados13. Além disso, os MSCs têm a capacidade de segregar exosósmos, vesículas extracelulares na nanoescala que carregam uma carga de RNAs não codificantes, proteínas e fatores solúveis, que recentemente surgiram como um novo mecanismo do potencial terapêutico dos MSCs em várias doenças14.
Mais importante, os MSCs têm gerado atenção marcante para seu potencial de diferenciação em células produtoras de insulina (IPCs), seja por modificação genética15,16 ou através da utilização de vários fatores indutores extrínsecos dentro da mídia cultural in vitro17. O período de indução do IPC varia muito, pois depende do protocolo de indução utilizado e dos fatores extrínsecos utilizados. O processo de diferenciação pode durar de dias a meses, e requer uma combinação de fatores indutores exógenos que devem ser adicionados e/ou retirados em diferentes estágios. Muitos desses fatores que têm sido utilizados para a diferenciação pancreática endócrina são compostos biologicamente ativos que têm sido mostrados para promover a proliferação ou diferenciação/neogênese de células β e/ou aumentar o teor de insulina dos IPCs 18,19,20,21. Vale ressaltar aqui que os MSCs também têm tido efeitos terapêuticos no diabetes e suas complicações através de diversos mecanismos, incluindo seu secretome, bem como uma ampla gama de ações imuno-modulatórias 22,23,24.
Neste protocolo, apresentamos um protocolo passo detalhado para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs a partir de gordura epidídica de ratos, seguido por um protocolo simples e relativamente curto para a geração de IPCs a partir de Ad-MSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, conseguimos apresentar um protocolo detalhado para o isolamento dos Ad-MSCs da gordura epidídica de ratos e a diferenciação desses Ad-MSCs em IPCs. De fato, a gordura epidídimal de rato é uma fonte facilmente atingível de tecido adiposo para a obtenção de Ad-MSCs e não requer nenhum equipamento especial, nem para coleta nem para processamentode 15,26,27. Os Ad-MSCs isolados apresentaram excelente expans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos a Dra. Rawda Samir Mohamed, MSc, Especialista Em Veterinária, Faculdade de Farmácia da Universidade Britânica do Egito (BUE) por ajudar na dissecação dos ratos.
Também gostaríamos de reconhecer e apreciar os esforços da Faculdade de Comunicação de Massa, a Universidade Britânica no Egito (BUE) para a produção e edição do vídeo deste manuscrito.
Gostaríamos de agradecer à Srta. Fatma Masoud, MSc, Professora Assistente de Inglês, Universidade Britânica no Egito (BUE) pela revisão e revisão da língua inglesa do manuscrito.
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculdade de Farmácia, Universidade Britânica no Egito (BUE), Cairo, Egito.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
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