عزل الخلايا الجذعية الوسيطة للأنسجة الدهنية للفئران للتمايز إلى خلايا منتجة للأنسولين
Summary
يمكن أن تكون الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) مصدرا محتملا ل MSCs التي تتمايز إلى خلايا منتجة للأنسولين (IPCs). في هذا البروتوكول ، نقدم خطوات مفصلة لعزل وتوصيف الفئران البربخية Ad-MSCs ، متبوعة ببروتوكول بسيط وقصير لتوليد IPCs من نفس الفئران Ad-MSCs.
Abstract
اكتسبت الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) – وخاصة تلك المعزولة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) – اهتماما خاصا كمصدر متجدد وفير للخلايا الجذعية التي لا تشكل أي مخاوف أخلاقية. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية لعزل Ad-MSCs ليست موحدة وتستخدم بروتوكولات معقدة تتطلب معدات خاصة. لقد عزلنا Ad-MSCs من الدهون البربخية لفئران Sprague-Dawley باستخدام طريقة بسيطة قابلة للتكرار. عادة ما تظهر Ad-MSCs المعزولة في غضون 3 أيام بعد العزل ، حيث تعرض الخلايا الملتصقة مورفولوجيا الأرومة الليفية. هذه الخلايا تصل إلى 80 ٪ التقاء في غضون 1 أسبوع من العزل. بعد ذلك ، في الممر 3-5 (P3-5) ، تم إجراء توصيف كامل ل Ad-MSCs المعزولة عن طريق التنميط المناعي لمجموعة MSC المميزة من علامات سطح التمايز (CD) مثل CD90 و CD73 و CD105 ، بالإضافة إلى تحفيز تمايز هذه الخلايا أسفل السلالات العظمية والشحمية والغضرونية. وهذا بدوره يعني تعدد قدرات الخلايا المعزولة. علاوة على ذلك ، قمنا بتحفيز تمايز Ad-MSCs المعزولة نحو سلالة الخلايا المنتجة للأنسولين (IPCs) عبر بروتوكول بسيط وقصير نسبيا من خلال دمج وسط النسر المعدل عالي الجلوكوز في Dulbecco (HG-DMEM) ، β-mercaptoethanol ، nicotinamide ، و exendin-4. تم تقييم تمايز IPCs وراثيا ، أولا ، عن طريق قياس مستويات التعبير عن علامات محددة للخلايا β مثل MafA و NKX6.1 و Pdx-1 و Ins1 ، بالإضافة إلى تلطيخ dithizone ل IPCs المتولدة. ثانيا ، تم إجراء التقييم أيضا وظيفيا عن طريق فحص إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS). في الختام ، يمكن عزل Ad-MSCs بسهولة ، وعرض جميع معايير توصيف MSC ، ويمكنها بالفعل توفير مصدر وفير ومتجدد ل IPCs في المختبر لأبحاث مرض السكري.
Introduction
الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، والمعروفة أيضا باسم الخلايا اللحمية الوسيطة ، هي من بين أنواع الخلايا الأكثر استخداما على نطاق واسع للطب التجديدي 1,2. يتم تصنيفها على أنها خلايا جذعية بالغة وتتميز بإمكانات التمايز متعدد السلالات وقدرة التجديد الذاتي3. يمكن عزل MSCs والحصول عليها من مصادر مختلفة ، بما في ذلك الأنسجة الدهنية ونخاع العظام والدم المحيطي وأنسجة الحبل السري والدم وبصيلات الشعر والأسنان 4,5.
ينظر إلى عزل الخلايا الجذعية عن الأنسجة الدهنية على أنه جذاب وواعد على حد سواء بسبب سهولة الوصول إليها ، والتوسع السريع في المختبر ، والعائد العالي6. يمكن عزل الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) من أنواع مختلفة مثل البشر والأبقار والفئران والجرذان ، ومؤخرا الماعز7. لقد ثبت أن Ad-MSCs هي الآن مرشحة محتملة لهندسة الأنسجة والعلاج الجيني / الخلوي الذي يمكن استخدامه حتى لتطوير بديل ذاتي لإصلاح إصابة الأنسجة الرخوة أو عيوبها على المدى الطويل 7,8.
حددت الجمعية الدولية للعلاج الخلوي والجيني (ISCT) ثلاثة معايير دنيا يجب أن تظهرها MSCs للتوصيف الكامل9. أولا ، يجب أن يكونوا من أتباع البلاستيك. ثانيا ، يجب أن تعبر MSCs عن علامات سطح الخلايا الجذعية الوسيطة مثل CD73 و CD90 و CD105 وتفتقر إلى التعبير عن علامات المكونة للدم CD45 أو CD34 أو CD14 أو CD11b أو CD79α أو CD19 و HLA-DR. أخيرا ، يجب أن تظهر MSCs القدرة على التمييز في السلالات الوسيطة الثلاثة: الخلايا الشحمية ، الخلايا العظمية ، والخلايا الغضروفية. ومن المثير للاهتمام ، يمكن أن تتمايز MSCs أيضا إلى سلالات أخرى مثل الخلايا العصبية ، والخلايا العضلية القلبية ، وخلايا الكبد ، والخلايا الظهارية10،11.
في الواقع ، تمتلك MSCs خصائص فريدة تمكنها من تطبيقها كعوامل علاجية محتملة في العلاج التجديدي للأمراض المختلفة. يمكن ل MSCs إفراز عوامل قابلة للذوبان للحث على بيئة مناعية توفر فوائد علاجية12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تهاجر MSCs نحو مواقع الإصابة والبيئات الدقيقة للورم لتقديم العلاج المستهدف ؛ ومع ذلك ، لم يتم توضيح الآليات بشكل كامل13. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع MSCs بالقدرة على إفراز الإكسوسومات ، والحويصلات خارج الخلية في المقياس النانوي التي تحمل شحنة من الحمض النووي الريبي غير المشفر ، والبروتين ، والعوامل القابلة للذوبان ، والتي ظهرت مؤخرا كآلية جديدة للإمكانات العلاجية ل MSCs في مختلف الأمراض14.
الأهم من ذلك ، أن MSCs قد ولدت اهتماما ملحوظا لقدرتها على التمايز إلى خلايا منتجة للأنسولين (IPCs) ، إما عن طريق التعديل الوراثي15,16 أو من خلال استخدام مختلف العوامل الخارجية المحفزة داخل وسائط الثقافة في المختبر17. تختلف فترة تحريض IPC اختلافا كبيرا ، لأنها تعتمد على بروتوكول الحث المستخدم والعوامل الخارجية المستخدمة. يمكن أن تستمر عملية التمايز من أيام إلى أشهر ، وتتطلب مزيجا من العوامل الخارجية التي يجب إضافتها و / أو سحبها في مراحل مختلفة. العديد من هذه العوامل التي تم استخدامها لتمايز البنكرياس الغدد الصماء هي مركبات نشطة بيولوجيا ثبت أنها تعزز انتشار أو تمايز / النشأة الجديدة للخلايا β المفرزة للأنسولين و / أو تزيد من محتوى الأنسولين في IPCs18،19،20،21. ومن الجدير بالذكر هنا أنه تم الإبلاغ أيضا عن أن MSCs لها آثار علاجية في مرض السكري ومضاعفاته عبر العديد من الآليات ، بما في ذلك إفرازاتها ، بالإضافة إلى مجموعة واسعة من الإجراءات المناعية22،23،24.
في هذا البروتوكول ، نقدم بروتوكولا مفصلا تدريجيا لعزل وتوصيف Ad-MSCs من الدهون البربخية للفئران ، متبوعا ببروتوكول بسيط وقصير نسبيا لتوليد IPCs من Ad-MSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، تمكنا من تقديم بروتوكول مفصل لعزل Ad-MSCs عن الدهون البربخية للفئران والتمايز بين Ad-MSCs هذه في IPCs. في الواقع ، تعد الدهون اللبدينة للفئران مصدرا يمكن الوصول إليه بسهولة للأنسجة الدهنية للحصول على Ad-MSCs ولا تتطلب أي معدات خاصة ، لا للجمع ولا لمعالجة15،<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر الدكتورة روضة سمير محمد ، ماجستير ، أخصائي طبيب بيطري ، كلية الصيدلة ، الجامعة البريطانية في مصر (BUE) للمساعدة في تشريح الفئران.
كما نود أن نعرب عن تقديرنا وتقديرنا للجهود التي تبذلها كلية الإعلام بالجامعة البريطانية في مصر لإنتاج وتحرير فيديو هذه المخطوطة.
نود أن نشكر الآنسة فاطمة مسعود، ماجستير، محاضرة مساعدة في اللغة الإنجليزية، الجامعة البريطانية في مصر (BUE) على مراجعة المخطوطة وتصحيحها باللغة الإنجليزية.
تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مركز أبحاث وتطوير الأدوية (CDRD) ، كلية الصيدلة ، الجامعة البريطانية في مصر (BUE) ، القاهرة ، مصر.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton’s jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton’s jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
