Extraction et purification de la protéine FAHD1 du rein de porc et du foie de souris

La protéine 1 eucaryote contenant le domaine FAH (FAHD1) agit sous forme d’oxaloacétate bifonctionnel (OAA), decarboxylase (ODx)¹ et d’hydrolase acylpyruvate (ApH)². Il est localisé dans les mitochondries² et appartient à la vaste superfamille faH des enzymes 1,2,3,4,5,6. Bien que son activité ApH ne soit que d’une pertinence mineure, l’activité ODx de FAHD1 est impliquée dans la régulation du flux de cycle TCA 1,7,8,9. L’OAA est non seulement nécessaire pour la réaction centrale de la citrate synthase dans le cycle de l’acide tricarboxylique, mais agit également comme un inhibiteur compétitif de la succinate déshydrogénase dans le cadre du système de transport d’électrons et comme métabolite cataplérotique. La régulation négative de l’expression du gène FAHD1 dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) a entraîné une réduction significative du taux de prolifération cellulaire¹⁰ et une inhibition significative du potentiel de la membrane mitochondriale, associée à un passage concomitant à la glycolyse. Le modèle de travail fait référence à la sénescence associée au dysfonctionnement mitochondrial (MiDAS)phénotype 8 de type ^MiDAS,11, où les niveaux d’OAA mitochondrial sont étroitement régulés par l’activité ^{FAHD1 1,8,9}.

La protéine recombinante est plus facile à obtenir par l’expression et la purification à partir de bactéries¹² plutôt que de tissus. Cependant, une protéine exprimée dans les bactéries peut être biaisée par l’absence possible de modifications post-traductionnelles, ou peut simplement être problématique (c.-à-d. en raison de la perte de plasmides, des réponses au stress bactérien, des liaisons disulfures déformées / non formées, de l’absence ou d’une mauvaise sécrétion, de l’agrégation des protéines, du clivage protéolytique, etc.). Pour certaines applications, la protéine doit être obtenue à partir de lysat cellulaire ou de tissu, afin d’inclure de telles modifications et/ou d’exclure d’éventuels artefacts. Les protéines purifiées des tissus favorisent le développement d’anticorps de haute qualité et/ou d’inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques pour certaines enzymes, comme pour FAHD1¹³.

Ce manuscrit présente une série de méthodes pour l’extraction et la purification de FAHD1 à partir de reins de porcs et de foies de souris. Les méthodes décrites nécessitent une chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC), mais utilisent autrement un équipement de laboratoire commun. D’autres méthodes peuvent être trouvées ailleurs 14,15,16,17. Après l’extraction des protéines totales, le protocole proposé comprend une phase d’essai, au cours de laquelle les sous-protocoles de précipitation du sulfate d’ammonium et de chromatographie par échange ionique sont discutés (figure 1). Après avoir défini ces sous-protocoles, la protéine d’intérêt est extraite via une stratégie séquentielle utilisant l’échange ionique et la chromatographie d’exclusion de taille avec FPLC. Sur la base de ces lignes directrices, le protocole final peut être adapté individuellement à d’autres protéines d’intérêt.

Figure 1 : La stratégie globale de ce protocole. De haut en bas : Les protéines sont extraites des tissus. L’homogénat tissulaire est préparé, centrifugé et filtré. Pour chaque paire d’échantillons surnageants et d’échantillons dérivés de granulés, des tests de précipitation de sulfate d’ammonium et de chromatographie par échange ionique (FPLC) doivent être effectués pour sonder les conditions optimales. Après avoir établi ces sous-protocoles, la protéine peut être extraite par une procédure séquentielle de précipitation du sulfate d’ammonium, de chromatographie par échange ionique et de chromatographie d’exclusion de taille répétitive (FPLC) à des concentrations variables de pH et de sel. Toutes les étapes doivent être contrôlées par transfert western. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.