Investigação espectrométrica de massa multifacetada de neuropeptídeos em Callinectes sapidus

O sistema nervoso é complexo e requer uma rede de neurônios para transmitir sinais através de um organismo. O sistema nervoso coordena informações sensoriais e resposta biológica. As interações complexas e complicadas envolvidas na transmissão de sinais requerem muitas moléculas de sinalização diferentes, como neurotransmissores, esteroides e neuropeptídeos. Como os neuropeptídeos são as mais diversas e potentes moléculas de sinalização que desempenham papéis-chave na ativação de respostas fisiológicas ao estresse e outros estímulos, é de interesse determinar seu papel específico nesses processos fisiológicos. A função neuropeptídeo está relacionada à sua estrutura de aminoácidos, que determina mobilidade, interação receptora e afinidade¹. Técnicas como a histoquímica, importante porque os neuropeptídeos podem ser sintetizados, armazenados e liberados em diferentes regiões do tecido, e a eletrofisiologia têm sido empregadas para investigar a estrutura e função do neuropeptídeo ^2,3,4, mas esses métodos são limitados pelo throughput e especificidade para resolver a vasta diversidade sequencial de neuropeptídeos.

A espectrometria de massa (MS) permite a análise de alto rendimento da estrutura e abundância do neuropeptídeo. Isso pode ser realizado através de diferentes técnicas de EM, mais comumente cromatografia-eletrospraização líquida MS (LC-ESI-MS)⁵ e desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-MS)⁶. Utilizando medidas de massa de alta precisão e fragmentação de MS, a MS fornece a capacidade de atribuir sequência de aminoácidos e status de modificação pós-translacional (PTM) a neuropeptídeos de misturas complexas sem conhecimento a priori para ajudar na verificação de sua função ^7,8. Além das informações qualitativas, a MS permite informações quantitativas de neuropeptídeos por meio de quantitação sem rótulos (LFQ) ou métodos baseados em rótulos, como rotulagem isotópica ou isobárica⁹. As principais vantagens do LFQ incluem sua simplicidade, baixo custo de análise e diminuição das etapas de preparação da amostra que podem minimizar a perda de amostras. No entanto, as desvantagens do LFQ incluem o aumento dos custos de tempo do instrumento, pois requer múltiplas réplicas técnicas para lidar com o erro quantitativo da variabilidade run-to-run. Isso também leva a uma diminuição da capacidade de quantificar com precisão pequenas variações. Os métodos baseados em rótulos são submetidos a uma variação menos sistemática, pois várias amostras podem ser rotuladas diferencialmente usando uma variedade de isótopos estáveis, combinados em uma amostra, e analisados através de espectrometria de massa simultaneamente. Isso também aumenta o rendimento, embora rótulos isotópicos possam ser demorados e caros para sintetizar ou comprar. A complexidade espectral do espectro de massa de varredura completa (MS1) também aumenta à medida que o multiplexing aumenta, o que diminui o número de neuropeptídeos únicos capazes de ser fragmentados e, portanto, identificados. Por outro lado, a rotulagem isobárica não aumenta a complexidade espectral no nível MS1, embora introduza desafios para analitos de baixa abundância, como neuropeptídeos. Como a quantitação isobárica é realizada no nível de espectro de massa de íons de fragmento (MS2), neuropeptídeos de baixa abundância podem ser incapazes de ser quantificados, pois componentes matriciais mais abundantes podem ser selecionados para fragmentação e aqueles selecionados podem não ter abundância alta o suficiente para serem quantificados. Com rotulagem isotópica, a quantitação pode ser realizada em todos os peptídeos identificados.

Além da identificação e quantificação, as informações de localização podem ser obtidas pela MS através de imagens MALDI-MS (MALDI-MSI)¹⁰. Ao rasterar um laser através de uma superfície de amostra, os espectros ms podem ser compilados em uma imagem de mapa de calor para cada valor m/z . Mapear a intensidade do sinal de neuropeptídeo transitório em diferentes regiões em condições pode fornecer informações valiosas para a determinação da função¹¹. A localização de neuropeptídeos é especialmente importante porque a função neuropeptídeo pode diferir dependendo do local¹².

Neuropeptídeos são encontrados em menor abundância in vivo do que outras moléculas de sinalização, como neurotransmissores, e assim requerem métodos sensíveis para detecção¹³. Isso pode ser alcançado através da remoção de componentes de matriz de maior abundância, como lipídios^11,14. Considerações adicionais para a análise de neuropeptídeos precisam ser feitas quando comparadas aos fluxos de trabalho proteômicos comuns, principalmente porque a maioria das análises neuropeptidômicas omitem a digestão enzimática. Isso limita as opções de software para análise de dados de neuropeptídeos, pois a maioria foi construída com algoritmos baseados em dados de proteômica e correspondências de proteínas informadas pela detecção de peptídeos. No entanto, muitos softwares como o PEAKS¹⁵ são mais adequados à análise de neuropeptídeos devido às suas capacidades de sequenciamento de novo. Vários fatores precisam ser considerados para a análise de neuropeptídeos a partir do método de extração à análise de dados em MS.

Os protocolos descritos aqui incluem métodos para preparação de amostras e rotulagem isotópica de dimetila, aquisição de dados e análise de dados de neuropeptídeos por LC-ESI-MS, MALDI-MS e MALDI-MS. Através de resultados representativos de vários experimentos, demonstra-se a utilidade e a capacidade desses métodos de identificar, quantificar e localizar neuropeptídeos de caranguejos azuis, Callinectes sapidus. Para entender melhor o sistema nervoso, os sistemas de modelos são comumente usados. Muitos organismos não têm um genoma totalmente sequenciado disponível, o que impede a descoberta abrangente de neuropeptídeos no nível do peptídeo. Para mitigar esse desafio, está incluído um protocolo de identificação de novos neuropeptídeos e mineração de transcriptome para gerar bancos de dados para organismos sem informações completas do genoma. Todos os protocolos aqui apresentados podem ser otimizados para amostras de neuropeptídeos de qualquer espécie, bem como aplicados para a análise de quaisquer peptídeos endógenos.