カリネクテス・サピドゥスにおける神経ペプチドの多面的質量分析調査

神経系は複雑であり、生物全体に信号を伝達するためにニューロンのネットワークを必要とする。神経系は感覚情報と生物学的反応を調整します。シグナル伝達に関与する複雑で複雑な相互作用は、神経伝達物質、ステロイド、および神経ペプチドなどの多くの異なるシグナル伝達分子を必要とする。神経ペプチドは、ストレスおよび他の刺激に対する生理学的応答を活性化する上で重要な役割を果たす最も多様で強力なシグナル伝達分子であるため、これらの生理学的プロセスにおけるそれらの特異的役割を決定することは興味深い。神経ペプチドの機能は、移動度、受容体相互作用、および親和性を決定するアミノ酸構造に関連しています¹。神経ペプチドの構造と機能を調べるために、神経ペプチドが組織の異なる領域で合成、保存、放出され得るため重要である組織化学、および電気生理学などの技術が採用されてきた^2,3,4が、これらの方法は、神経ペプチドの膨大な配列多様性を解明するためのスループットおよび特異性によって制限されている。

質量分析(MS)は、神経ペプチドの構造と存在量のハイスループット分析を可能にします。これは、さまざまなMS技術、最も一般的には液体クロマトグラフィー – エレクトロスプレーイオン化MS(LC-ESI-MS)⁵およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化MS(MALDI-MS)⁶を介して行うことができる。高精度の質量測定とMSフラグメンテーションを利用して、MSは、先験的な知識なしに複雑な混合物からの神経ペプチドにアミノ酸配列および翻訳後修飾(PTM)ステータスを割り当てる能力を提供し、その機能を確認するのに役立ちます^7,8。定性的な情報に加えて、MSは標識フリー定量(LFQ)または同位体または等圧標識などの標識ベースの方法を通じて神経ペプチドの定量情報を可能にします⁹。LFQの主な利点には、そのシンプルさ、分析の低コスト、サンプル損失を最小限に抑えることができるサンプル調製ステップの削減が含まれます。しかし、LFQの欠点は、実行ごとの変動性からの定量的誤差に対処するために複数の技術的反復を必要とするため、計測器の時間コストの増加です。これはまた、小さな変動を正確に定量化する能力の低下にもつながる。標識ベースの方法は、複数のサンプルをさまざまな安定同位体を使用して差動的に標識し、1つのサンプルに結合し、質量分析によって同時に分析できるため、系統的な変動が少なくなります。これによりスループットも向上しますが、同位体標識は合成や購入に時間とコストがかかる可能性があります。フルスキャンマススペクトル(MS1)スペクトルの複雑さも多重化が増加するにつれて増加し、断片化して同定することができるユニークな神経ペプチドの数が減少する。逆に、等圧標識はMS1レベルでスペクトルの複雑さを増大させませんが、神経ペプチドなどの低存在量の分析物には課題をもたらします。等圧定量はフラグメントイオン質量スペクトル(MS2)レベルで行われるため、より豊富なマトリックス成分がフラグメンテーションのために選択され得るので、存在量の低い神経ペプチドは定量することができず、選択されたものは定量されるのに十分な存在量を有しない可能性がある。同位体標識により、同定されたすべてのペプチドに対して定量を行うことができます。

同定および定量化に加えて、局在化情報は、MALDI−MSイメージング(MALDI−MSI)¹⁰を介してMSによって得ることができる。サンプル表面を横切ってレーザーをラスタリングすることにより、MSスペクトルを各 m/z 値のヒートマップ画像にコンパイルすることができます。条件全体にわたる異なる領域における一過性ニューロペプチドシグナル強度のマッピングは、機能決定のための貴重な情報^{を提供することができる11}。神経ペプチドの局在化は、神経ペプチドの機能が位置¹²によって異なる可能性があるため、特に重要である。

神経ペプチドは、神経伝達物質などの他のシグナル伝達分子よりもインビボで存在量が少なく、したがって検出には高感度な方法が必要である¹³。これは、脂質¹¹、¹⁴などのより存在量の多いマトリックス成分の除去によって達成することができる。神経ペプチドの分析のための追加の考慮事項は、主にほとんどのneuropeptidomic分析が酵素消化を省略しているため、一般的なプロテオミクスワークフローと比較すると、行う必要があります。これは、ほとんどがプロテオミクスデータとペプチド検出によって知らされたタンパク質一致に基づくアルゴリズムで構築されたため、神経ペプチドデータ分析のためのソフトウェアオプションを制限します。しかし、PEAKS¹⁵などの多くのソフトウェアは、de novoシーケンシング機能により、神経ペプチド分析に適しています。抽出法からMSデータ解析までの神経ペプチドの解析には、いくつかの要因を考慮する必要があります。

ここで説明するプロトコルには、LC-ESI-MS、MALDI-MS、およびMALDI-MSIによる神経ペプチドのサンプル調製およびジメチル同位体標識、データ取得、およびデータ分析のための方法が含まれる。いくつかの実験からの代表的な結果を通して、青いカニ、 カリネクテス・サピドゥスからの神経ペプチドを同定、定量、および局在化するこれらの方法の有用性および能力が実証される。神経系をよりよく理解するために、モデル系が一般的に使用される。多くの生物は、完全に配列決定されたゲノムを利用可能にしていないため、ペプチドレベルでの包括的な神経ペプチドの発見を妨げている。この課題を軽減するために、完全なゲノム情報を持たない生物のデータベースを生成するための新規神経ペプチドおよびトランスクリプトームマイニングを同定するためのプロトコルが含まれる。ここで提示されるすべてのプロトコールは、任意の種からの神経ペプチドサンプルに対して最適化することができ、また、任意の内因性ペプチドの分析に適用することができる。