Summary

Indagine spettrometrica di massa sfaccettata di neuropeptidi in Callinectes sapidus

Published: May 31, 2022
doi:

Summary

La caratterizzazione spettrometrica di massa dei neuropeptidi fornisce informazioni di sequenza, quantificazione e localizzazione. Questo flusso di lavoro ottimizzato non è utile solo per gli studi sui neuropeptidi, ma anche per altri peptidi endogeni. I protocolli forniti qui descrivono la preparazione del campione, l’acquisizione della SM, l’analisi della SM e la generazione di neuropeptidi nel database utilizzando LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting e MALDI-MS imaging.

Abstract

I neuropeptidi sono molecole di segnalazione che regolano quasi tutti i processi fisiologici e comportamentali, come lo sviluppo, la riproduzione, l’assunzione di cibo e la risposta a fattori di stress esterni. Tuttavia, i meccanismi biochimici e il pieno complemento dei neuropeptidi e i loro ruoli funzionali rimangono poco compresi. La caratterizzazione di questi peptidi endogeni è ostacolata dall’immensa diversità all’interno di questa classe di molecole di segnalazione. Inoltre, i neuropeptidi sono bioattivi a concentrazioni 100x – 1000x inferiori a quelle dei neurotrasmettitori e sono soggetti a degradazione enzimatica dopo il rilascio sinaptico. La spettrometria di massa (MS) è uno strumento analitico altamente sensibile in grado di identificare, quantificare e localizzare analiti senza una conoscenza a priori completa. È adatto per profilare globalmente i neuropeptidi e aiutare nella scoperta di nuovi peptidi. A causa della bassa abbondanza e dell’elevata diversità chimica di questa classe di peptidi, diversi metodi di preparazione del campione, parametri di acquisizione della SM e strategie di analisi dei dati sono stati adattati dalle tecniche di proteomica per consentire una caratterizzazione ottimale dei neuropeptidi. Qui, vengono descritti metodi per isolare i neuropeptidi da tessuti biologici complessi per la caratterizzazione, la quantificazione e la localizzazione della sequenza utilizzando la cromatografia liquida (LC)-MS e il desorbimento / ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI)-MS. È incluso un protocollo per la preparazione di un database di neuropeptidi dal granchio blu, Callinectes sapidus, un organismo senza informazioni genomiche complete. Questi flussi di lavoro possono essere adattati per studiare altre classi di peptidi endogeni in diverse specie utilizzando una varietà di strumenti.

Introduction

Il sistema nervoso è complesso e richiede una rete di neuroni per trasmettere segnali in tutto l’organismo. Il sistema nervoso coordina le informazioni sensoriali e la risposta biologica. Le interazioni intricate e contorte coinvolte nella trasmissione del segnale richiedono molte molecole di segnalazione diverse come neurotrasmettitori, steroidi e neuropeptidi. Poiché i neuropeptidi sono le molecole di segnalazione più diverse e potenti che svolgono un ruolo chiave nell’attivazione delle risposte fisiologiche allo stress e ad altri stimoli, è interessante determinare il loro ruolo specifico in questi processi fisiologici. La funzione neuropeptidica è correlata alla loro struttura aminoacidica, che determina la mobilità, l’interazione del recettore e l’affinità1. Tecniche come l’istochimica, che è importante perché i neuropeptidi possono essere sintetizzati, immagazzinati e rilasciati in diverse regioni del tessuto, e l’elettrofisiologia sono state impiegate per studiare la struttura e la funzionedei neuropeptidi 2,3,4, ma questi metodi sono limitati dal throughput e dalla specificità per risolvere la vasta diversità di sequenze dei neuropeptidi.

La spettrometria di massa (MS) consente l’analisi ad alto rendimento della struttura e dell’abbondanza dei neuropeptidi. Questo può essere eseguito attraverso diverse tecniche di SM, più comunemente cromatografia liquida-ionizzazione elettrospray MS (LC-ESI-MS)5 e desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice MS (MALDI-MS)6. Utilizzando misurazioni di massa ad alta precisione e frammentazione della SM, MS fornisce la possibilità di assegnare la sequenza di amminoacidi e lo stato di modificazione post-traduzionale (PTM) ai neuropeptidi da miscele complesse senza conoscenza a priori per aiutare ad accertare la loro funzione 7,8. Oltre alle informazioni qualitative, la SM consente l’informazione quantitativa dei neuropeptidi attraverso la quantificazione senza etichetta (LFQ) o metodi basati su etichette come l’etichettatura isotopica o isobarica9. I principali vantaggi di LFQ includono la sua semplicità, il basso costo di analisi e la riduzione delle fasi di preparazione del campione che possono ridurre al minimo la perdita di campioni. Tuttavia, gli svantaggi di LFQ includono l’aumento dei costi di tempo dello strumento in quanto richiede più repliche tecniche per affrontare l’errore quantitativo dovuto alla variabilità run-to-run. Ciò porta anche a una diminuzione della capacità di quantificare con precisione piccole variazioni. I metodi basati su etichette sono soggetti a variazioni meno sistematiche in quanto più campioni possono essere etichettati in modo differenziale utilizzando una varietà di isotopi stabili, combinati in un unico campione e analizzati simultaneamente attraverso la spettrometria di massa. Ciò aumenta anche la produttività, sebbene le etichette isotopiche possano richiedere molto tempo e denaro da sintetizzare o acquistare. Anche la complessità spettrale degli spettri di massa a scansione completa (MS1) aumenta con l’aumentare del multiplexing, il che diminuisce il numero di neuropeptidi unici in grado di essere frammentati e, quindi, identificati. Al contrario, l’etichettatura isobarica non aumenta la complessità spettrale a livello MS1, sebbene introduca sfide per gli analiti a bassa abbondanza come i neuropeptidi. Poiché la quantificazione isobarica viene eseguita a livello degli spettri di massa ionica del frammento (MS2), i neuropeptidi a bassa abbondanza potrebbero non essere in grado di essere quantificati poiché componenti della matrice più abbondanti possono essere selezionati per la frammentazione e quelli selezionati potrebbero non avere un’abbondanza abbastanza elevata da essere quantificati. Con l’etichettatura isotopica, la quantificazione può essere eseguita su ogni peptide identificato.

Oltre all’identificazione e alla quantificazione, le informazioni di localizzazione possono essere ottenute dagli SM tramite l’imaging MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Rasterizzando un laser su una superficie campione, gli spettri MS possono essere compilati in un’immagine della mappa di calore per ogni valore m/z . La mappatura dell’intensità del segnale neuropeptidico transitorio in diverse regioni attraverso le condizioni può fornire informazioni preziose per la determinazione della funzione11. La localizzazione dei neuropeptidi è particolarmente importante perché la funzione del neuropeptide può differire a seconda della posizione12.

I neuropeptidi si trovano in una minore abbondanza in vivo rispetto ad altre molecole di segnalazione, come i neurotrasmettitori, e quindi richiedono metodi sensibili per il rilevamento13. Ciò può essere ottenuto attraverso la rimozione di componenti della matrice a maggiore abbondanza, come i lipidi11,14. Ulteriori considerazioni per l’analisi dei neuropeptidi devono essere fatte rispetto ai comuni flussi di lavoro di proteomica, principalmente perché la maggior parte delle analisi neuropeptidomiche omettono la digestione enzimatica. Ciò limita le opzioni software per l’analisi dei dati neuropeptidici poiché la maggior parte sono stati costruiti con algoritmi basati su dati proteomici e corrispondenze proteiche informate dal rilevamento di peptidi. Tuttavia, molti software come PEAKS15 sono più adatti all’analisi dei neuropeptidi grazie alle loro capacità di sequenziamento de novo. Diversi fattori devono essere considerati per l’analisi dei neuropeptidi a partire dal metodo di estrazione all’analisi dei dati della SM.

I protocolli qui descritti includono metodi per la preparazione del campione e l’etichettatura isotopica del dimetilico, l’acquisizione dei dati e l’analisi dei dati dei neuropeptidi da parte di LC-ESI-MS, MALDI-MS e MALDI-MSI. Attraverso i risultati rappresentativi di diversi esperimenti, viene dimostrata l’utilità e la capacità di questi metodi di identificare, quantificare e localizzare i neuropeptidi dei granchi blu, Callinectes sapidus. Per comprendere meglio il sistema nervoso, i sistemi modello sono comunemente usati. Molti organismi non hanno un genoma completamente sequenziato disponibile, il che impedisce la scoperta completa di neuropeptidi a livello peptidico. Al fine di mitigare questa sfida, è incluso un protocollo per l’identificazione di nuovi neuropeptidi e l’estrazione di trascrittomi per generare database per organismi senza informazioni complete sul genoma. Tutti i protocolli qui presentati possono essere ottimizzati per campioni di neuropeptidi di qualsiasi specie, nonché applicati per l’analisi di qualsiasi peptide endogeno.

Protocol

Tutti i prelievi di tessuto descritti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell’Università del Wisconsin-Madison. 1. Analisi LC-ESI-MS dei neuropeptidi Estrazione e dissalazione di neuropeptidi Prima dell’acquisizione dei tessuti, preparare metanolo acidificato (acMeOH) (90:9:1 MeOH:acqua:acido acetico) come descritto in16. Raccogliere il tessuto cerebrale dal crostaceo17 e utilizzar…

Representative Results

Il flusso di lavoro per la preparazione dei campioni e l’analisi ms è illustrato nella Figura 1. Dopo la dissezione del tessuto neuronale, vengono eseguite l’omogeneizzazione, l’estrazione e la desalinizzazione per purificare i campioni di neuropeptide. Se si desidera una quantificazione isotopica basata sull’etichetta, i campioni vengono nuovamente etichettati e dissalati. Il campione risultante viene analizzato attraverso LC-MS/MS per l’identificazione e la quantificazione dei neuropeptid…

Discussion

L’identificazione accurata, la quantificazione e la localizzazione di neuropeptidi e peptidi endogeni presenti nel sistema nervoso sono cruciali per comprendere la loro funzione23,24. La spettrometria di massa è una tecnica potente che può consentire di realizzare tutto questo, anche in organismi senza un genoma completamente sequenziato. Viene dimostrata la capacità di questo protocollo di rilevare, quantificare e localizzare neuropeptidi da tessuti raccolti …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation (CHE-1710140 e CHE-2108223) e dal National Institutes of Health (NIH) attraverso la sovvenzione R01DK071801. A.P. è stato supportato in parte dal NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health, nell’ambito del Ruth L. Kirschstein National Research Service Award dal National Heart Lung and Blood Institute all’Università del Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. desidera riconoscere le sovvenzioni NIH R56 MH110215, S10RR029531 e S10OD025084, nonché il sostegno finanziario di una Vilas Distinguished Achievement Professorship e Charles Melbourne Johnson Professorship con finanziamenti forniti dalla Wisconsin Alumni Research Foundation e dalla University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Materials

Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix Supelco 39319
Acetic acid Fisher Chemical A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A955-500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Borane pyridine Sigma-Aldrich 179752
Bruker peptide calibration mix Bruker Daltonics NC9846988
Capillary Polymicro 1068150019 to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup Sigma-Aldrich E6032 any cup or mold should work
 Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30108434
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde – D2 Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Optima LC/MS grade Fisher Chemical A117-50
Gelatin Difco 214340 place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen Vector Labs 15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials Thermo TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A456-500
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Hydrophobic film
pH-Indicator strips Supelco 109450
Red phosphorus clusters Sigma-Aldrich 343242
Reversed phase C18 material Waters 186002350 manually packed into nanoflow column
Wite-out pen BIC 150810
ZipTip Millipore Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5 HTX Technologies, LLC
Centrifuge – 5424 R Eppendorf 05-401-205
Cryostat- HM 550 Thermo Fisher Scientific 956564A
Desiccant Drierite 2088701
Forceps WPI 501764
MALDI stainless steel target plate Bruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLS Rainin 17014391 200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics
SpeedVac – SVC100 Savant SVC-100D
Ultrasonic Cleaner Bransonic 2510R-MTH for sonication
Ultrasonic homogenizer Fisher Scientific FB120110 FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer Corning 6775
Water bath (37C) – Isotemp 110 Fisher Scientific 15-460-10
Data Analysis Software
Expasy https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis Bruker Daltonics
FlexControl Bruker Daltonics
FlexImaging Bruker Daltonics
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab https://scils.de/
SignalP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

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Cite This Article
Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus. J. Vis. Exp. (183), e63322, doi:10.3791/63322 (2022).

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