التحقيق الطيفي الكتلي متعدد الأوجه للببتيدات العصبية في Callinectes sapidus
Summary
يوفر التوصيف الطيفي الكتلي للببتيدات العصبية معلومات التسلسل والقياس الكمي والتوطين. سير العمل المحسن هذا ليس مفيدا فقط لدراسات الببتيد neuropeptide ، ولكن أيضا الببتيدات الداخلية الأخرى. تصف البروتوكولات المقدمة هنا إعداد العينات ، والحصول على MS ، وتحليل MS ، وتوليد قاعدة بيانات من neuropeptides باستخدام LC-ESI-MS ، MALDI-MS اكتشاف ، وتصوير MALDI-MS.
Abstract
الببتيدات العصبية هي جزيئات تشير إلى جميع العمليات الفسيولوجية والسلوكية تقريبا ، مثل التطوير والتكاثر وتناول الطعام والاستجابة للضغوطات الخارجية. ومع ذلك ، فإن الآليات البيوكيميائية والمجموعة الكاملة من الببتيدات العصبية وأدوارها الوظيفية لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. ويعوق توصيف هذه الببتيدات الذاتية المنشأ التنوع الهائل داخل هذه الفئة من جزيئات الإشارة. بالإضافة إلى ذلك ، تكون الببتيدات العصبية نشطة بيولوجيا بتركيزات أقل 100x – 1000x من تلك الموجودة في الناقلات العصبية وهي عرضة للتحلل الأنزيمي بعد الإطلاق المشبكي. قياس الطيف الكتلي (MS) هو أداة تحليلية حساسة للغاية يمكنها تحديد التحليلات وتحديدها كميا وتوطينها دون معرفة مسبقة شاملة. وهي مناسبة تماما لتحديد ملامح الببتيدات العصبية عالميا والمساعدة في اكتشاف الببتيدات الجديدة. نظرا للوفرة المنخفضة والتنوع الكيميائي العالي لهذه الفئة من الببتيدات ، تم تكييف العديد من طرق إعداد العينات ، ومعلمات اكتساب MS ، واستراتيجيات تحليل البيانات من تقنيات البروتينات للسماح بالتوصيف الأمثل ل neuropeptide. هنا ، يتم وصف طرق عزل الببتيدات العصبية عن الأنسجة البيولوجية المعقدة لتوصيف التسلسل والقياس الكمي والتوطين باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة (LC)-MS والامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI)-MS. يتم تضمين بروتوكول لإعداد قاعدة بيانات neuropeptide من سرطان البحر الأزرق ، Callinectes sapidus ، وهو كائن حي بدون معلومات جينومية شاملة. يمكن تكييف سير العمل هذا لدراسة فئات أخرى من الببتيدات الذاتية المنشأ في أنواع مختلفة باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات.
Introduction
الجهاز العصبي معقد ويتطلب شبكة من الخلايا العصبية لنقل الإشارات عبر الكائن الحي. ينسق الجهاز العصبي المعلومات الحسية والاستجابة البيولوجية. تتطلب التفاعلات المعقدة والمعقدة التي ينطوي عليها نقل الإشارة العديد من جزيئات الإشارات المختلفة مثل الناقلات العصبية والمنشطات والببتيدات العصبية. نظرا لأن الببتيدات العصبية هي جزيئات الإشارة الأكثر تنوعا وقوة التي تلعب أدوارا رئيسية في تنشيط الاستجابات الفسيولوجية للإجهاد والمحفزات الأخرى ، فمن المهم تحديد دورها المحدد في هذه العمليات الفسيولوجية. ترتبط وظيفة Neuropeptide ببنية الأحماض الأمينية الخاصة بها ، والتي تحدد الحركة وتفاعل المستقبلات والتقارب1. تقنيات مثل الكيمياء النسيجية ، وهو أمر مهم لأنه يمكن توليف الببتيدات العصبية وتخزينها وإطلاقها في مناطق مختلفة من الأنسجة ، وقد تم استخدام الفيزيولوجيا الكهربية للتحقيق في بنية الببتيد neuropeptide ووظيفتها 2,3,4 ، ولكن هذه الطرق محدودة بالإنتاجية والخصوصية لحل تنوع التسلسل الهائل من neuropeptides.
يتيح قياس الطيف الكتلي (MS) تحليل الإنتاجية العالية لبنية الببتيد النيوروبي ووفرته. ويمكن القيام بذلك من خلال تقنيات MS المختلفة، والأكثر شيوعا الكروماتوغرافيا السائلة – التأين الكهربائي MS (LC-ESI-MS)5 والامتزاز/التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة MS (MALDI-MS)6. باستخدام قياسات الكتلة عالية الدقة وتجزئة MS ، يوفر MS القدرة على تعيين تسلسل الأحماض الأمينية وحالة التعديل بعد الترجمة (PTM) إلى neuropeptides من مخاليط معقدة دون معرفة مسبقة للمساعدة في التحقق من وظيفتها 7,8. بالإضافة إلى المعلومات النوعية، يتيح MS المعلومات الكمية عن الببتيدات العصبية من خلال القياس الكمي الخالي من الملصقات (LFQ) أو الطرق القائمة على الملصقات مثل وضع العلامات النظيرية أو المتساوية الضغط9. تشمل المزايا الرئيسية ل LFQ بساطتها وانخفاض تكلفة التحليل وانخفاض خطوات إعداد العينات التي يمكن أن تقلل من فقدان العينة. ومع ذلك ، فإن عيوب LFQ تشمل زيادة تكاليف وقت الأداة لأنها تتطلب تكرارات تقنية متعددة لمعالجة الخطأ الكمي من التباين من تشغيل إلى تشغيل. وهذا يؤدي أيضا إلى انخفاض القدرة على تحديد الاختلافات الصغيرة بدقة. تخضع الطرق القائمة على الملصقات لتباين أقل منهجية حيث يمكن تصنيف عينات متعددة بشكل تفاضلي باستخدام مجموعة متنوعة من النظائر المستقرة ، ودمجها في عينة واحدة ، وتحليلها من خلال قياس الطيف الكتلي في وقت واحد. وهذا يزيد أيضا من الإنتاجية، على الرغم من أن الملصقات النظيرية يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ومكلفة في توليفها أو شرائها. كما يزداد التعقيد الطيفي لأطياف كتلة المسح الكامل (MS1) مع زيادة تعدد الإرسال ، مما يقلل من عدد الببتيدات العصبية الفريدة التي يمكن تجزئتها وبالتالي تحديدها. وعلى العكس من ذلك، فإن وضع العلامات متساوي الضغط لا يزيد من التعقيد الطيفي على مستوى MS1، على الرغم من أنه يقدم تحديات للتحليلات منخفضة الوفرة مثل الببتيدات العصبية (neuropeptides). وبما أن القياس الكمي متساوي الضغط يتم إجراؤه على مستوى أطياف كتلة أيون الشظايا (MS2)، فقد لا يمكن تحديد كمية الببتيدات العصبية منخفضة الوفرة حيث يمكن اختيار مكونات مصفوفة أكثر وفرة للتجزئة وقد لا يكون لدى تلك المختارة وفرة عالية بما يكفي لتحديدها كميا. مع وضع العلامات النظيرية ، يمكن إجراء القياس الكمي على كل ببتيد محدد.
بالإضافة إلى التحديد والقياس الكمي، يمكن الحصول على معلومات التوطين بواسطة MS من خلال تصوير MALDI-MS (MALDI-MSI)10. عن طريق تنقيط ليزر عبر سطح عينة، يمكن تجميع أطياف MS في صورة خريطة حرارية لكل قيمة m/z . يمكن أن يوفر رسم خرائط كثافة إشارة neuropeptide العابرة في مناطق مختلفة عبر الظروف معلومات قيمة لتحديد الوظيفة11. توطين الببتيدات العصبية مهم بشكل خاص لأن وظيفة neuropeptide قد تختلف اعتمادا على الموقع12.
تم العثور على Neuropeptides بوفرة أقل في الجسم الحي من جزيئات الإشارات الأخرى ، مثل الناقلات العصبية ، وبالتالي تتطلب طرقا حساسة للكشف13. يمكن تحقيق ذلك من خلال إزالة مكونات مصفوفة الوفرة العالية ، مثل الدهون11,14. يجب إجراء اعتبارات إضافية لتحليل الببتيدات العصبية عند مقارنتها بسير عمل البروتيوميات الشائعة ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن معظم التحليلات غير المنطقية العصبية تحذف الهضم الأنزيمي. هذا يحد من خيارات البرامج لتحليل بيانات neuropeptide حيث تم بناء معظمها باستخدام خوارزميات تعتمد على بيانات البروتينات ومطابقة البروتين المستنيرة باكتشاف الببتيد. ومع ذلك ، فإن العديد من البرامج مثل PEAKS15 أكثر ملاءمة لتحليل neuropeptide بسبب قدراتها على تسلسل de novo. هناك عدة عوامل يجب مراعاتها لتحليل الببتيدات العصبية بدءا من طريقة الاستخراج إلى تحليل بيانات التصلب المتعدد.
وتشمل البروتوكولات الموصوفة هنا طرقا لإعداد العينات ووضع العلامات على نظائر ثنائي الميثيل، والحصول على البيانات، وتحليل بيانات الببتيدات العصبية بواسطة LC-ESI-MS، MALDI-MS، وMALDI-MSI. من خلال النتائج التمثيلية للعديد من التجارب ، يتم إثبات فائدة وقدرة هذه الطرق على تحديد وقياس وتوطين الببتيدات العصبية من سرطان البحر الأزرق ، Callinectes sapidus. لفهم الجهاز العصبي بشكل أفضل ، يتم استخدام أنظمة النماذج بشكل شائع. العديد من الكائنات الحية ليس لديها جينوم متسلسل بالكامل متاح ، مما يمنع اكتشاف neuropeptide الشامل على مستوى الببتيد. ومن أجل التخفيف من حدة هذا التحدي، أدرج بروتوكول لتحديد الببتيدات العصبية الجديدة وتعدين النسخ لإنشاء قواعد بيانات للكائنات الحية التي لا تحتوي على معلومات كاملة عن الجينوم. يمكن تحسين جميع البروتوكولات المعروضة هنا لعينات neuropeptide من أي نوع ، وكذلك تطبيقها لتحليل أي ببتيدات داخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد التحديد الدقيق والقياس الكمي والتوطين للببتيدات العصبية والببتيدات الداخلية الموجودة في الجهاز العصبي أمرا بالغ الأهمية لفهم وظيفتها23,24. قياس الطيف الكتلي هو تقنية قوية يمكن أن تسمح بتحقيق كل هذا ، حتى في الكائنات الحية التي لا تحتوي على جينوم متسلسل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (CHE-1710140 و CHE-2108223) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) من خلال منحة R01DK071801. تم دعم A.P. جزئيا من قبل منحة التدريب على واجهة الكيمياء والبيولوجيا في المعاهد الوطنية للصحة (T32 GM008505). تم دعم N.V.Q. جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، بموجب جائزة Ruth L. Kirschstein National Research Service Award من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم إلى مركز أبحاث القلب والأوعية الدموية بجامعة ويسكونسن ماديسون (T32 HL007936). L.L. يود أن يعرب عن تقديره لمنح المعاهد الوطنية للصحة R56 MH110215 و S10RR029531 و S10OD025084 ، بالإضافة إلى دعم التمويل من أستاذية Vilas للإنجاز المتميز وأستاذية تشارلز ملبورن جونسون بتمويل مقدم من مؤسسة أبحاث خريجي ويسكونسن وكلية الصيدلة بجامعة ويسكونسن ماديسون.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides – an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
