تمايز قوي ل iPSCs البشرية إلى مجموعة نقية من الخلايا الشحمية لدراسة الاضطرابات المرتبطة بالخلايا الشحمية
Summary
يسمح البروتوكول بتوليد مجموعة من الخلايا الشحمية النقية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). يستخدم حمض الريتينويك للتمييز بين الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا جذعية وسيطة (MSCs) تستخدم لإنتاج الخلايا الشحمية. بعد ذلك ، يتم استخدام نهج الفرز على أساس تلطيخ النيل الأحمر للحصول على الخلايا الشحمية النقية.
Abstract
سمحت التطورات الحديثة في تقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) بتوليد أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، فإن طرق التمايز الحالية لها كفاءة منخفضة ولا تنتج مجموعة متجانسة من الخلايا الشحمية. هنا ، نتحايل على هذه المشكلة باستخدام طريقة قائمة على الريتينويك بالكامل لإنتاج الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ذات العائد العالي. من خلال تنظيم المسارات التي تحكم تكاثر الخلايا وبقائها والالتصاق ، تسمح استراتيجية التمايز الخاصة بنا بالتوليد الفعال للأجسام الجنينية (EBs) التي تتمايز إلى مجموعة نقية من MSCs متعددة القدرات. يوفر العدد الكبير من MSCs الناتجة عن هذه الطريقة مصدرا مثاليا لتوليد الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، لا يزال عدم تجانس العينة الناتج عن تمايز الخلايا الشحمية يمثل تحديا. لذلك ، استخدمنا طريقة تعتمد على أحمر النيل لتنقية الخلايا الشحمية الناضجة الحاملة للدهون باستخدام FACS. سمحت لنا استراتيجية الفرز هذه بإنشاء طريقة موثوقة لنمذجة الاضطرابات الأيضية المرتبطة بالخلايا الشحمية باستخدام مجموعة من الخلايا الشحمية مع تقليل عدم تجانس العينة وتحسين وظائف الخلية.
Introduction
تعمل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كمورد انتقالي فعال لإنتاج خلايا من أصل الأديم المتوسط مثل الخلايا الشحمية والخلايا العظمية والخلايا الغضروفية ، والتي يمكن استخدامها بشكل أكبر لنمذجة الاضطرابات الوراثية الخاصة بكل منها. ومع ذلك ، اعتمدت الأساليب السابقة على الحصول على هذه MSCs من الأنسجة البالغة 1 ، مما فرض التحدي المتمثل في الحصول عليها بأعداد كبيرة من المتبرعين ، والحد من إبقائها قابلة للحياة وظيفيا في ظروف الزراعة المختبرية دون المستوى الأمثل 1,2. أنتجت هذه العقبات طلبا كبيرا على وجود بروتوكول لتوليد MSCs في المختبر. يمكن استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) كمصدر قيم ل MSCs ، حيث تظهر خصائص MSC3،4،5. يمكن استخدام MSCs المشتقة من iPSCs كخيار علاجي في العديد من الأمراض. أيضا ، فإن قدرة MSCs المشتقة من iPSCs على توليد الخلايا الشحمية ، تجعلها نموذجا بشريا قيما في المختبر لدراسة تكوين الدهون البشرية والسمنة والاضطرابات المرتبطة بالخلايا الشحمية.
يمكن تصنيف بروتوكولات التمايز الحالية للخلايا الشحمية إلى مجموعتين ، إحداهما تتضمن تمايز الخلايا الشحمية باستخدام الكوكتيلات الكيميائية أو البروتينية التي تعطي عائدا ناتجا بنسبة 30٪ -60٪ 6،7،8،9 ، بينما تتضمن الأخرى التلاعب الجيني لتحريض قوي لعوامل النسخ الرئيسية التي تحكم تطور الخلايا الشحمية لإعطاء عائد 80٪ -90٪ 10 ، 11. ومع ذلك ، فإن التلاعب الجيني لا يلخص العملية الطبيعية لتمايز الخلايا الشحمية ، وغالبا ما يخفي النماذج الدقيقة التي تصل أثناء تكوين الدهون ، مما يجعلها غير فعالة لأغراض نمذجة المرض12،13. لذلك ، نقدم طريقة لفرز الخلايا الشحمية الناضجة المشتقة كيميائيا من الخلايا الشحمية غير الناضجة عن طريق وضع علامات على الخلايا الشحمية الحاملة للدهون باستخدام أحمر النيل.
نقدم هنا بروتوكولا يتضمن الحضانة العابرة للأجسام الجنينية المشتقة من iPSCs (EBs) مع حمض الريتينويك المتحولة بالكامل لإنتاج عدد كبير من MSCs سريعة التكاثر ، والتي يمكن استخدامها بشكل أكبر لتوليد الخلايا الشحمية14. نقدم أيضا طريقة لفرز الخلايا الشحمية الناضجة المشتقة كيميائيا من مجموعة التمايز غير المتجانسة عن طريق وضع علامات على قطرات الدهون الخاصة بها باستخدام صبغة محبة للدهون. أحمر النيل. وهذا من شأنه أن يسمح بتوليد مجموعة نقية من الخلايا الشحمية الناضجة مع وظائف محسنة لنمذجة الاضطرابات الأيضية المرتبطة بالخلايا الشحمية بدقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحمل هذا البروتوكول أهمية قصوى نظرا لقدرته على توفير MSCs بإنتاجية وكفاءة عالية. أصبح هذا الإنتاج الضخم ل MSCs ممكنا من خلال الحضانة العابرة ل EBs المشتقة من iPSCs مع 10 ميكرومتر من RA14,15. عززت المعالجة العابرة ب 10 ميكرومتر من التهاب المفاصل الروماتويدي عائد MSC بمقدار …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من الصندوق القطري لرعاية البحث العلمي (رقم المنحة NPRP10-1221-160041). حصلت مريم أغادي على منحة دراسية من GSRA من الصندوق القطري لرعاية البحث العلمي (QNRF).
Materials
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
References
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
