使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变

在可兴奋细胞中测量快速钙波的问题是研究中枢和周围神经系统信号传输的最重要和最具挑战性的方面之一。钙离子在触发神经递质释放、突触可塑性和调节各种细胞^内蛋白的活性方面起着重要作用1，²，³，^4，5。研究钙信号传导对于寻找治疗神经退^{行性疾病的方法}也很重要6。为了测量钙水平的变化，通常使用荧光钙敏感染料，并分析其荧光水平的变化⁷，^8，9。

钙染料加载到细胞中可以通过不同的方式实现。主要使用细胞渗透性染料^10，11。然而，在这种情况下，不仅难以控制细胞内染料的浓度，而且也很难选择目标细胞进行上样。该方法不适用于研究周围神经末梢，因为染料进入突触后细胞。相反，细胞不透透的染料更适合这种制剂。在这种情况下，染料通过显微注射或通过贴片移液管^12，13，14递送到细胞。还有一种通过神经残端加载的方法。后一种方法最适合于神经肌肉接头制剂¹⁵，16，¹⁷，^18，19，20。它允许仅对感兴趣的细胞进行染色。尽管该方法不能准确评估靶细胞中染料的浓度，但可以通过比较溶液中静止细胞的荧光水平与已知浓度的钙²¹来近似估计浓度。在这项研究中，提出了应用于哺乳动物突触的该方法的修改。

在动作电位的去极化阶段钙进入是一个快速的过程，特别是在神经肌肉接头;因此，对于其注册，需要适当的设备¹.最近使用电压敏感荧光染料的一项研究表明，小鼠外周突触中动作电位的持续时间约为300μs²²。在青蛙的外围突触中使用钙敏感染料评估钙瞬变的持续时间更长：上升时间约为2-6毫秒，衰减时间约为30-90毫秒，具体取决于使用的钙染料^23，24。为了在荧光染料的帮助下测量快速过程，通常使用CCD或CMOS相机，以及快速灵敏的CCD矩阵。然而，这些相机具有低分辨率的缺点，受限于矩阵^25、26、^27、28的敏感元件的大小。最快的相机具有足够的灵敏度来记录响应细胞低频刺激的动作电位和钙瞬变，扫描频率为2，000 Hz，矩阵尺寸为80 x 80²⁹。为了获得具有更高空间分辨率的信号，使用共聚焦显微镜，特别是当需要评估信号中的一些体积变化时³⁰，^31，32。但应该记住，共聚焦显微镜在线扫描模式下具有很高的扫描速度，但在构建空间图像时，记录快速过程的速度仍然存在显着限制³³。有基于旋转Nipkow盘（狭缝扫描显微镜）的共聚焦显微镜和具有更高扫描速度的多点阵列扫描仪。同时，它们在共聚焦图像滤波（带有Nipkow盘的显微镜的针孔串扰）方面不如经典共聚焦显微镜³²，^34，35。具有共振扫描的共聚焦成像还可以提供高时间测量所需的高时空分辨率³⁶。然而，考虑到当使用共振扫描仪时，以高扫描速度配准弱荧光响应需要高灵敏度的检测器，例如混合检测器³⁶。

本文提出了一种提高激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）记录的信号的时间分辨率，同时保持空间分辨率³⁷的方法。目前的方法是前面描述的方法的进一步发展，并转移到LSCM平台^38，39，40。这种方法不需要改变显微镜硬件，并且基于一种算法的应用，用于记录周期性诱发的荧光信号，具有相对于刺激时刻的时间偏移。