بروتوكول قائم على التشريح المجهري بالليزر لتحليل LC-MS / MS للملف البروتيني لحبيبات الميلانين العصبية
Summary
يتم تقديم بروتوكول قوي هنا لعزل حبيبات الميلانين العصبية من الأنسجة البشرية بعد الوفاة المادة السوداء pars compacta عن طريق التشريح المجهري بالليزر. يقلل هذا البروتوكول المنقح والمحسن بشكل كبير من الوقت المطلوب لجمع العينات ، ويقلل من كمية العينة المطلوبة ، ويعزز تحديد البروتينات وقياسها عن طريق تحليل LC-MS / MS.
Abstract
Neuromelanin هو صبغة سوداء بنية اللون ، موجودة في ما يسمى حبيبات الميلانين العصبية (NMGs) في الخلايا العصبية الدوبامينية من المادة السوداء pars compacta. إلى جانب الميلانين العصبي ، تحتوي NMGs على مجموعة متنوعة من البروتينات والدهون والمعادن. على الرغم من أن الخلايا العصبية الدوبامينية المحتوية على NMGs تضيع بشكل تفضيلي في الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون والخرف مع أجسام ليوي ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل عن آلية تكوين NMG ودور NMGs في الصحة والمرض. وبالتالي ، من الضروري إجراء مزيد من البحوث حول التوصيف الجزيئي ل NMGs. لسوء الحظ ، تعتمد البروتوكولات القياسية لعزل البروتينات على الطرد المركزي الفائق المتدرج الكثافة وبالتالي تتطلب كميات كبيرة من الأنسجة البشرية. وبالتالي ، يتم إنشاء بروتوكول آلي قائم على التشريح المجهري بالليزر (LMD) هنا والذي يسمح بجمع NMGs والأنسجة المحيطة بالمادة السوداء (SN) باستخدام كميات قليلة من الأنسجة بطريقة غير متحيزة وآلية. يتم تحليل العينات المستأصلة لاحقا عن طريق قياس الطيف الكتلي لفك رموز تركيبها البروتيني. مع سير العمل هذا ، تم تحديد 2079 بروتينا منها 514 بروتينا تم تحديدها حصريا في NMGs و 181 في SN. تمت مقارنة النتائج الحالية مع دراسة سابقة باستخدام نهج مماثل قائم على LMD حيث وصل التداخل بنسبة 87.6٪ لكل من البروتينات ، مما يتحقق من قابلية تطبيق البروتوكول المنقح والمحسن المقدم هنا. للتحقق من صحة النتائج الحالية ، تم تحليل البروتينات ذات الأهمية بواسطة قياس الطيف الكتلي المستهدف ، على سبيل المثال ، تجارب مراقبة التفاعل المتوازي (PRM).
Introduction
يتكون كل نسيج من خليط غير متجانس من أنواع مختلفة من الخلايا ، ولكن العزلة المحددة لنوع واحد من الخلايا غالبا ما تكون لا غنى عنها لتوصيف أكثر دقة. يعد التشريح المجهري بالليزر (LMD) ، الذي يقترن المجهر بتطبيق الليزر ، أداة قوية للعزل المحدد لمناطق الأنسجة أو الخلايا المفردة أو الهياكل الفرعية الخلوية من مركب معقد. تم بالفعل تنفيذ تطبيق LMD بالاشتراك مع قياس الطيف الكتلي (LMD-MS) بنجاح للعديد من الأسئلة البحثية ، بما في ذلك عزل الحمض النووي1 والحمض النووي الريبي2 والبروتينات3،4،5. في هذا البروتوكول ، تم وصف بروتوكول LMD-MS المنقح والمحسن للتحليل البروتيني لأنسجة المخ البشرية بعد الوفاة والمكونات الخلوية الفرعية لفك رموز الآليات المرضية الجديدة لمرض باركنسون.
Neuromelanin هو صبغة سوداء غير قابلة للذوبان تقريبا موجودة في الخلايا العصبية الكاتيكولامينية المنتجة للدوبامين في المادة السوداء pars compacta6. جنبا إلى جنب مع البروتينات والدهون ، يتراكم في حبيبات تشبه العضيات محاطة بغشاء مزدوج ، يسمى حبيبات الميلانين العصبية (NMGs)7،8،9. يمكن ملاحظة NMGs من سن ثلاث سنوات في البشر زيادة في الكمية والكثافة أثناء عملية الشيخوخة10,11. حتى الآن ، لا توجد فرضية محددة حول تكوين الميلانين العصبي ، ولكن أحد الافتراضات هو أن الميلانين العصبي يتشكل من خلال أكسدة الدوبامين12. تستند الفرضيات الأخرى إلى الإنتاج الأنزيمي للميلانين العصبي (على سبيل المثال ، التيروزيناز)13. تم العثور على الميلانين العصبي نفسه لديه تقارب ارتباط كبير بالدهون والسموم وأيونات المعادن والمبيدات الحشرية. بناء على هذه النتائج ، يفترض أن تكوين NMGs يحمي الخلية من تراكم المواد السامة والأكسدة ومن السموم البيئية14,15. إلى جانب هذه الوظيفة العصبية ، هناك أدلة على أن الميلانين العصبي قد يسبب تأثيرات تنكسية عصبية ، على سبيل المثال ، عن طريق تشبع الحديد والتحفيز اللاحق للجذور الحرة16،17. علاوة على ذلك ، يمكن أن يتحلل الميلانين العصبي الذي يتم إطلاقه أثناء العمليات التنكسية العصبية بواسطة بيروكسيد الهيدروجين ، مما قد يسرع النخر بواسطة المعادن التفاعلية والمركبات السامة الأخرى المرتبطة سابقا بالميلانين العصبي وقد يساهم في التهاب الأعصاب وتلف الخلايا18. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن الدور الدقيق ل NMGs في العمليات التنكسية العصبية كما هو الحال في سياق مرض باركنسون غير مفهوم بوضوح. ومع ذلك ، يبدو أن NMGs متورطة في التسبب في مرض باركنسون وتحليلها المحدد له أهمية قصوى لكشف دورها في التنكس العصبي. لسوء الحظ ، تفتقر المختبر الشائعة (مثل الفئران والجرذان) وخطوط الخلايا إلى NMGs19. لذلك ، يعتمد الباحثون بشكل خاص على أنسجة المخ بعد الوفاة لتحليلهم. في الماضي ، اعتمدت عزلة NMG بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة على توافر كميات كبيرة من الأنسجة السوداء 20,21. اليوم ، يقدم LMD أداة متعددة الاستخدامات لعزل NMGs على وجه التحديد من عينات الدماغ البشري ثم تحليلها بواسطة LC-MS / MS.
في هذا البروتوكول ، يتم تقديم نسخة محسنة وآلية من البروتوكولالسابق 22 لعزل NMGs والأنسجة المحيطة (SN) ، مما يتيح توليد عينات أسرع ، وأعداد أكبر من البروتينات المحددة والكمية ، وانخفاض حاد في كميات الأنسجة المطلوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
LMD هي تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لعزل مناطق أنسجة معينة أو خلايا مفردة أو هياكل تحت خلوية. في البروتوكول المنقح والآلي المقدم هنا ، يتم تطبيق هذه التقنية للعزل المحدد لحبيبات الميلانين العصبية (NMGs) والأنسجة المحيطة ب NMG (SN). حتى الآن ، تم نشر نهجين مختلفين لعزل NMGs من أنسجة المخ البشرية …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل de. NBI ، وهو مشروع تابع للوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث (BMBF) (رقم المنحة FKZ 031 A 534A) و P.U.R.E. (وحدة أبحاث البروتين الرور داخل أوروبا) ومركز تشخيص البروتين (ProDi) ، كلاهما من وزارة الابتكار والعلوم والبحوث في شمال الراين وستفاليا ، ألمانيا.
Materials
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -. K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson’s disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson’s disease. NPJ Parkinson’s Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- . Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn’s diagrams Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007)
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
