Rening av endogena Drosophila transienta receptorpotentialkanaler
Summary
Baserat på monteringsmekanismen för INAD-proteinkomplexet utvecklades i detta protokoll en modifierad affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena den endogena Drosophila TRP-kanalen.
Abstract
Drosophila fototransduktion är en av de snabbaste kända G-proteinkopplade signalvägarna. För att säkerställa specificiteten och effektiviteten hos denna kaskad binder kalcium (Ca2+)-permeabel katjonkanal, transient receptorpotential (TRP), tätt till ställningsproteinet, inaktivering-no-after-potential D (INAD), och bildar ett stort signalproteinkomplex med ögonspecifikt proteinkinas C (ePKC) och fosfogpas Cβ/No receptorpotential A (PLCβ/NORPA). De biokemiska egenskaperna hos Drosophila TRP-kanalen är emellertid fortfarande oklara. Baserat på monteringsmekanismen för INAD-proteinkomplex utvecklades en modifierad affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena den endogena TRP-kanalen. Först bands det renade histidin (His) -märkta NORPA 863-1095-fragmentet till Ni-pärlor och användes som bete för att dra ner det endogena INAD-proteinkomplexet från Drosophila-huvudhomogenater. Sedan tillsattes överdrivet renat glutation S-transferas (GST)-märkt TRP 1261-1275-fragment till Ni-pärlorna för att konkurrera med TRP-kanalen. Slutligen separerades TRP-kanalen i supernatanten från den överdrivna TRP 1261-1275-peptiden genom storleksuteslutningskromatografi. Denna metod gör det möjligt att studera gatingmekanismen hos Drosophila TRP-kanalen från både biokemiska och strukturella vinklar. Elektrofysiologiska egenskaper hos renade Drosophila TRP-kanaler kan också mätas i framtiden.
Introduction
Fototransduktion är en process där absorberade fotoner omvandlas till elektriska koder för neuroner. Det vidarebefordrar uteslutande opsiner och följande G-proteinkopplade signalkaskad hos både ryggradsdjur och ryggradslösa djur. I Drosophila, genom att använda sina fem PDZ-domäner, organiserar scaffold protein inactivation-no-after-potential D (INAD) ett supramolekylärt signalkomplex, som består av en övergående receptorpotential (TRP) kanal, fosfolipas Cβ / No receptorpotential A (PLCβ / NORPA) och ögonspecifikt proteinkinas C (ePKC)1. Bildandet av detta supramolekylära signalkomplex garanterar korrekt subcellulär lokalisering, hög effektivitet och specificitet hos Drosophila fototransduktionsmaskineri. I detta komplex fungerar ljuskänsliga TRP-kanaler som nedströms effektorer av NORPA och förmedlar kalciuminflöde och depolarisering av fotoreceptorer. Tidigare studier visade att öppningen av Drosophila TRP-kanalen förmedlas av protoner, störningar i den lokala lipidmiljön eller mekanisk kraft 2,3,4. Drosophila TRP-kanalen interagerar också med kalmodulin5 och moduleras av kalcium genom både positiv och negativ återkoppling 6,7,8.
Hittills har elektrofysiologiska studier av grindmekanismen för Drosophila TRP- och TRP-liknande (TRPL) kanaler baserats på utskurna membranplåster, helcellsinspelningar från dissocierade Drosophila-fotoreceptorer av vild typ och hetero-uttryckta kanaler i S2-, SF9- eller HEK-celler 2,9,10,11,12,13, men inte på renade kanaler. Den strukturella informationen om Drosophila TRP-kanalen i full längd är också oklar. För att studera de elektrofysiologiska egenskaperna hos renat protein i en rekonstituerad membranmiljö och för att få strukturell information om Drosophila TRP-kanalen i full längd är erhållande av renade TRP-kanaler i full längd det nödvändiga första steget, liknande de metoder som används i däggdjurs TRP-kanalstudier 14,15,16,17.
Nyligen, baserat på monteringsmekanismen för INAD-proteinkomplex 18,19,20, utvecklades först en affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena TRP-kanalen från Drosophila-huvudhomogenater med streptavidinpärlor 5. Med tanke på den låga kapaciteten och dyra kostnaden för streptavidinpärlor introduceras här ett förbättrat reningsprotokoll som använder His-taggat beteprotein och motsvarande billiga Ni-pärlor med mycket högre kapacitet. Den föreslagna metoden kommer att bidra till att studera TRP-kanalens grindmekanism från strukturella vinklar och att mäta de elektrofysiologiska egenskaperna hos TRP-kanalen med renade proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD, som innehåller fem PDZ-domäner, är kärnorganisatören av Drosophila fototransduktionsmaskineri. Tidigare studier visade att INAD PDZ3 binder till TRP-kanalens C-terminala svans med utsökt specificitet (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interagerar med NORPA 863-1095 fragment med en extremt hög bindningsaffinitet (KD = 30 nM). Dessa fynd ger en solid biokemisk grund för att utforma affinitetsrening plus konkurrensstrategi, vilket gör att NORPA CC-PBM-fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) och Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2021A1515010796) till W. L. Vi tackar LetPub (www.letpub.com) för dess språkliga hjälp under utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. 신경과학. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).
