Baserat på monteringsmekanismen för INAD-proteinkomplexet utvecklades i detta protokoll en modifierad affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena den endogena Drosophila TRP-kanalen.
Drosophila fototransduktion är en av de snabbaste kända G-proteinkopplade signalvägarna. För att säkerställa specificiteten och effektiviteten hos denna kaskad binder kalcium (Ca2+)-permeabel katjonkanal, transient receptorpotential (TRP), tätt till ställningsproteinet, inaktivering-no-after-potential D (INAD), och bildar ett stort signalproteinkomplex med ögonspecifikt proteinkinas C (ePKC) och fosfogpas Cβ/No receptorpotential A (PLCβ/NORPA). De biokemiska egenskaperna hos Drosophila TRP-kanalen är emellertid fortfarande oklara. Baserat på monteringsmekanismen för INAD-proteinkomplex utvecklades en modifierad affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena den endogena TRP-kanalen. Först bands det renade histidin (His) -märkta NORPA 863-1095-fragmentet till Ni-pärlor och användes som bete för att dra ner det endogena INAD-proteinkomplexet från Drosophila-huvudhomogenater. Sedan tillsattes överdrivet renat glutation S-transferas (GST)-märkt TRP 1261-1275-fragment till Ni-pärlorna för att konkurrera med TRP-kanalen. Slutligen separerades TRP-kanalen i supernatanten från den överdrivna TRP 1261-1275-peptiden genom storleksuteslutningskromatografi. Denna metod gör det möjligt att studera gatingmekanismen hos Drosophila TRP-kanalen från både biokemiska och strukturella vinklar. Elektrofysiologiska egenskaper hos renade Drosophila TRP-kanaler kan också mätas i framtiden.
Fototransduktion är en process där absorberade fotoner omvandlas till elektriska koder för neuroner. Det vidarebefordrar uteslutande opsiner och följande G-proteinkopplade signalkaskad hos både ryggradsdjur och ryggradslösa djur. I Drosophila, genom att använda sina fem PDZ-domäner, organiserar scaffold protein inactivation-no-after-potential D (INAD) ett supramolekylärt signalkomplex, som består av en övergående receptorpotential (TRP) kanal, fosfolipas Cβ / No receptorpotential A (PLCβ / NORPA) och ögonspecifikt proteinkinas C (ePKC)1. Bildandet av detta supramolekylära signalkomplex garanterar korrekt subcellulär lokalisering, hög effektivitet och specificitet hos Drosophila fototransduktionsmaskineri. I detta komplex fungerar ljuskänsliga TRP-kanaler som nedströms effektorer av NORPA och förmedlar kalciuminflöde och depolarisering av fotoreceptorer. Tidigare studier visade att öppningen av Drosophila TRP-kanalen förmedlas av protoner, störningar i den lokala lipidmiljön eller mekanisk kraft 2,3,4. Drosophila TRP-kanalen interagerar också med kalmodulin5 och moduleras av kalcium genom både positiv och negativ återkoppling 6,7,8.
Hittills har elektrofysiologiska studier av grindmekanismen för Drosophila TRP- och TRP-liknande (TRPL) kanaler baserats på utskurna membranplåster, helcellsinspelningar från dissocierade Drosophila-fotoreceptorer av vild typ och hetero-uttryckta kanaler i S2-, SF9- eller HEK-celler 2,9,10,11,12,13, men inte på renade kanaler. Den strukturella informationen om Drosophila TRP-kanalen i full längd är också oklar. För att studera de elektrofysiologiska egenskaperna hos renat protein i en rekonstituerad membranmiljö och för att få strukturell information om Drosophila TRP-kanalen i full längd är erhållande av renade TRP-kanaler i full längd det nödvändiga första steget, liknande de metoder som används i däggdjurs TRP-kanalstudier 14,15,16,17.
Nyligen, baserat på monteringsmekanismen för INAD-proteinkomplex 18,19,20, utvecklades först en affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena TRP-kanalen från Drosophila-huvudhomogenater med streptavidinpärlor 5. Med tanke på den låga kapaciteten och dyra kostnaden för streptavidinpärlor introduceras här ett förbättrat reningsprotokoll som använder His-taggat beteprotein och motsvarande billiga Ni-pärlor med mycket högre kapacitet. Den föreslagna metoden kommer att bidra till att studera TRP-kanalens grindmekanism från strukturella vinklar och att mäta de elektrofysiologiska egenskaperna hos TRP-kanalen med renade proteiner.
INAD, som innehåller fem PDZ-domäner, är kärnorganisatören av Drosophila fototransduktionsmaskineri. Tidigare studier visade att INAD PDZ3 binder till TRP-kanalens C-terminala svans med utsökt specificitet (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interagerar med NORPA 863-1095 fragment med en extremt hög bindningsaffinitet (KD = 30 nM). Dessa fynd ger en solid biokemisk grund för att utforma affinitetsrening plus konkurrensstrategi, vilket gör att NORPA CC-PBM-fr…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) och Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2021A1515010796) till W. L. Vi tackar LetPub (www.letpub.com) för dess språkliga hjälp under utarbetandet av detta manuskript.
Bacterial strains | |||
BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
Experiment models | |||
D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
Material | |||
20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
Equipment | |||
Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |