Rensing av endogene Drosophila transiente reseptorpotensialkanaler
Summary
Basert på monteringsmekanismen til INAD-proteinkomplekset, ble det i denne protokollen utviklet en modifisert affinitetsrensing pluss konkurransestrategi for å rense den endogene Drosophila TRP-kanalen.
Abstract
Drosophila fototransduksjon er en av de raskeste kjente G-proteinkoblede signalveiene. For å sikre spesifisiteten og effektiviteten til denne kaskaden, binder kalsium (Ca2+)-permeabel kationkanal, transient reseptorpotensial (TRP), tett til stillasproteinet, inaktivering-no-after-potential D (INAD), og danner et stort signalproteinkompleks med øyespesifikk proteinkinase C (ePKC) og fosfolipase Cβ/No-reseptorpotensial A (PLCβ/NORPA). Imidlertid er de biokjemiske egenskapene til Drosophila TRP-kanalen fortsatt uklare. Basert på monteringsmekanismen til INAD-proteinkomplekset ble det utviklet en modifisert affinitetsrensing pluss konkurransestrategi for å rense den endogene TRP-kanalen. Først ble det rensede histidinmerkede NORPA 863-1095-fragmentet bundet til Ni-perler og brukt som agn for å trekke ned det endogene INAD-proteinkomplekset fra Drosophila hodehomogenater. Deretter ble overdreven renset glutation S-transferase (GST) -merket TRP 1261-1275 fragment lagt til Ni-perlene for å konkurrere med TRP-kanalen. Til slutt ble TRP-kanalen i supernatanten skilt fra det overdrevne TRP 1261-1275-peptidet ved størrelseseksklusjonskromatografi. Denne metoden gjør det mulig å studere gatingmekanismen til Drosophila TRP-kanalen fra både biokjemiske og strukturelle vinkler. Elektrofysiologiegenskapene til rensede Drosophila TRP-kanaler kan også måles i fremtiden.
Introduction
Fototransduksjon er en prosess der absorberte fotoner omdannes til elektriske koder for nevroner. Den videresender utelukkende opsiner og følgende G-proteinkoblede signalkaskade hos både virveldyr og virvelløse dyr. I Drosophila, ved å bruke sine fem PDZ-domener, organiserer stillasproteininaktivering-no-after-potential D (INAD) et supramolekylært signalkompleks, som består av en transient reseptorpotensial (TRP) kanal, fosfolipase Cβ / No reseptorpotensial A (PLCβ / NORPA) og øyespesifikk proteinkinase C (ePKC) 1. Dannelsen av dette supramolekylære signalkomplekset garanterer riktig subcellulær lokalisering, høy effektivitet og spesifisitet av Drosophila fototransduksjonsmaskineri. I dette komplekset fungerer lysfølsomme TRP-kanaler som nedstrøms effektorer av NORPA og medierer kalsiumtilstrømning og depolarisering av fotoreseptorer. Tidligere studier viste at åpningen av Drosophila TRP-kanalen er mediert av protoner, forstyrrelse av det lokale lipidmiljøet eller mekanisk kraft 2,3,4. Drosophila TRP-kanalen interagerer også med calmodulin5 og moduleres av kalsium ved både positiv og negativ tilbakemelding 6,7,8.
Så langt var elektrofysiologistudier på gatingmekanismen til Drosophila TRP og TRP-lignende (TRPL) kanaler basert på utskårne membranplaster, helcelleopptak fra dissosierte wild-type Drosophila fotoreceptorer og hetero-uttrykte kanaler i S2, SF9 eller HEK-celler 2,9,10,11,12,13, men ikke på rensede kanaler. Den strukturelle informasjonen til Drosophila TRP-kanalen i full lengde er også uklar. For å studere de elektrofysiologiske egenskapene til renset protein i et rekonstituert membranmiljø og for å få strukturell informasjon om Drosophila TRP-kanalen i full lengde, er det nødvendig første trinnet å oppnå rensede TRP-kanaler i full lengde, i likhet med metodene som brukes i pattedyrs TRP-kanalstudier 14,15,16,17.
Nylig, basert på monteringsmekanismen til INAD-proteinkomplekset18,19,20, ble en affinitetsrensing pluss konkurransestrategi først utviklet for å rense TRP-kanalen fra Drosophila hodehomogenater av streptavidinperler5. Med tanke på den lave kapasiteten og dyre kostnaden for streptavidinperler, introduseres en forbedret renseprotokoll her som bruker His-tagged agnprotein og tilsvarende lavpris Ni-perler med mye høyere kapasitet. Den foreslåtte metoden vil bidra til å studere TRP-kanalens gatingmekanisme fra strukturelle vinkler og å måle de elektrofysiologiske egenskapene til TRP-kanalen med rensede proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD, som inneholder fem PDZ-domener, er kjernearrangøren av Drosophila fototransduksjonsmaskineri. Tidligere studier viste at INAD PDZ3 binder seg til TRP-kanalen C-terminal hale med utsøkt spesifisitet (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interagerer med NORPA 863-1095 fragment med ekstremt høy bindingsaffinitet (KD = 30 nM). Disse funnene gir et solid biokjemisk grunnlag for å utforme strategien affinitetsrensing pluss konkurranse, som gjør at NORPA CC-PBM-fra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) og Natural Science Foundation of Guangdong Province, Kina (nr. 2021A1515010796) til WL. Vi takker LetPub (www.letpub.com) for språklig hjelp under utarbeidelsen av dette manuskriptet.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. 신경과학. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).
