알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실 검출
Summary
여기에서는 아세트산 납 노출이 제브라 피쉬 유충의 뼈 질량 변화를 유발한다는 것을 보여주기 위해 알리자린 레드 염색을 사용했습니다. 이 염색 방법은 다른 위험한 독성 물질에 의해 유도 된 제브라 피쉬 유충 손실의 뼈 손실 조사에 적용될 수 있습니다.
Abstract
납(Pb) 노출로 인한 화학적으로 유발된 뼈 손실은 인간과 동물의 골격계 모두에 일련의 부정적인 영향을 유발할 수 있습니다. 그러나 제브라 피쉬의 구체적인 효과와 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. Alizarin red는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 뼈를 시각화하고 골격 미네랄 덩어리를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구에서는 알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 아세트산납(PbAc)으로 인한 뼈 손실을 감지하는 것을 목표로 했습니다. 제브라피쉬 배아는 수정 후 2시간에서 120시간 사이에 일련의 PbAc 농도(0, 5, 10, 20mg/L)로 처리되었습니다. 수정 후 9일에 유충에 대해 전체 마운트 골격 염색을 수행하고, 전체 염색 면적을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다. 결과는 광물화된 조직이 빨간색으로 염색되었고, PbAc 노출 그룹에서 염색된 영역이 유의하게 감소했으며, 뼈 광물화의 용량 의존적 변화가 있음을 나타냈다. 이 논문은 PbAc 유발 뼈 결함의 골격 변화를 조사하기 위한 염색 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다른 화학 물질에 의해 유도 된 뼈 손실을 감지하기 위해 제브라 피쉬 유충에서도 사용할 수 있습니다.
Introduction
최근 연구에 따르면 글루코 코르티코이드, 아로마 타제 억제제 및 과도한 알코올 섭취로 인한 골다공증이 흔하다는 것이 확인되었습니다 1,2. 납 (Pb)은 식물, 토양 및 수생 환경에서 발견되는 독성 금속입니다3. 인체에 대한 Pb의 악영향이 많은 관심을 끌었지만 뼈에 대한 돌이킬 수없는 영향은 더 조사해야합니다. 납 중독은 발달 중과 성인 골격 모두에서 다양한 병리학 적 변화를 일으켜 정상적인 생활 활동에 영향을 미칩니다. 연구에 따르면 만성 Pb 노출과 뼈 손상4 사이의 연관성이 발견되었으며, 여기에는 뼈 구조 손상5,6, 골밀도 감소, 골다공증 위험 증가7가 포함됩니다.
광물화된 조직은 뼈 강도8에 매우 중요하며, 골 광물화 매트릭스 침착은골 형성의 중요한 지표입니다9. 알리자린 레드는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 알리자린 레드 염색은 골 형성을 평가하기위한 표준 절차입니다10. 이 방법에 따르면, 광물 화 된 조직은 빨간색으로 염색되고 다른 모든 조직은 투명하게 유지됩니다. 염색 된 영역은 디지털 이미지 분석(11)에 의해 정량화된다.
제브라피쉬는 약물 발견 및 질병 모델에 널리 사용되는 중요한 모델 유기체입니다. 제브라 피쉬와 인간에 대한 유전 연구는 분자 수준12에서 골격 형태 형성의 기본 메커니즘에서 유사성을 입증했습니다. 더욱이, 고처리량 약물 또는 생체 분자 스크리닝은 쥐 모델보다 제브라피쉬의 큰 클러치에서 더 실현 가능하여, 프로오스테겐 또는 골독성 분자13의 기계론적 연구를 용이하게 한다. 토토10 에서 골격의 차별 염색은 작은 척추 동물과 포유류 태아에서 골격 이형성증을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 알리자린 레드 염색은 제브라피쉬 유충에서 화학 물질의 골 발생 독성을 조사하기 위해 수행되었습니다. 여기에서는 제브라피쉬 유충에서 납 아세테이트 유발 뼈 결함을 검출하기 위한 프로토콜을 설명하기 위해 납을 예로 사용했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제브라 피쉬는 뼈 대사 질환을 연구하기에 적합한 모델입니다. 설치류 모델에 비해 제브라 피쉬 모델은 비교적 빠르게 확립 할 수 있으며 질병의 중증도 측정이 더 쉽습니다. 야생형 제브라 피쉬 유충에서 머리 골격의 광물 화는 5dpf에서 발생하고 축 골격은 7dpf15에서 발생합니다. 따라서 PS, OP, CB 및 NC와 같은 두개골 뼈는 9dpf에서 잘 발달되어 있습니다. 유충이 완전히 염색되고 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81872646; 81811540034; 81573173)과 강소 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발 (PAPD)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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