Protocolos optimizados de muestreo óseo para la recuperación de ADN antiguo de restos arqueológicos

Toda la investigación presentada en este documento se realizó de acuerdo con las pautas establecidas por el Instituto Max Planck para la Ciencia de la Historia Humana, Jena, Alemania, para trabajar con restos humanos antiguos. Antes de realizar cualquier paso de este protocolo, asegúrese de cumplir con todos los requisitos éticos locales / estatales / federales relacionados con la obtención de permiso para el estudio científico y el uso de restos humanos para el muestreo destructivo en su área. Todos los procedimientos/almacenamiento de productos químicos deben realizarse de acuerdo con las directrices de seguridad institucionales individuales. 1. Consideraciones antes del procesamiento de muestras Trate las muestras con cuidado, ya que los restos antiguos son un recurso irreplicable y finito (por ejemplo, el muestreo debe ser lo menos derrochador posible, y todos los restos deben devolverse a sus respectivos y legítimos proveedores si es posible). Realice todos los pasos en un entorno de sala limpia, preferiblemente en una instalación dedicada al ADN antiguo17,18,19. Use equipo de protección personal (EPP) que consista en monos microporosos estériles con capucha, guantes estériles (dos pares), máscara quirúrgica, gafas protectoras y botas estériles o zapatos antideslizantes con cubiertas estériles (consulte la Tabla de materiales). Cambie los guantes con frecuencia, especialmente entre muestras. Limpie y desinfecte minuciosamente todos los equipos y superficies con lejía/solución de descontaminación de ADN/etanol e irradiación UV (longitud de onda: 254 nm) siempre que sea posible (por ejemplo, brocas, taladros, vises/abrazaderas, etc.). Finalmente, se recomienda encarecidamente tomar descansos ergonómicos regulares (cada 2-3 h si es posible) para evitar el agotamiento excesivo debido al ambiente de la sala limpia.NOTA: Todos los restos óseos deben documentarse adecuadamente (por ejemplo, fotografiados, pesados y, si es posible, escaneados por micro-TC, imágenes en 3D, etc.) antes del muestreo (los protocolos para la documentación apropiada no están cubiertos en este manuscrito). Todos los protocolos de muestreo pueden pausarse entre las iteraciones de muestreo y las muestras pueden almacenarse indefinidamente en un ambiente seco y estéril con temperatura controlada (25 °C). 2. Tratamiento previo Descontaminar todos los lugares de muestreo anatómico antes de la generación de polvo óseo para minimizar el riesgo de contaminación18.NOTA: La eficacia de la lejía y/o la eliminación de superficies (ver NOTA en el paso 3.3.2 para los pasos de eliminación de superficies) para la descontaminación de muestras sigue siendo un tema de debate entre los investigadores de ADNa 8,19,20,21,22,23,24,25 ya que ambos pueden influir en los rendimientos generales de ADN, especialmente en muestras altamente degradadas. Como tal, los siguientes pasos se consideran opcionales y se incluyen aquí, ya que se utilizaron en todas las muestras para generar los resultados representativos presentados en este documento. Se recomienda que el uso de estos protocolos de pretratamiento se determine caso por caso en función de la aplicación molecular, la edad, la rareza y el nivel de degradación morfológica de cada conjunto de muestras.Realice todas las muestras en una sala limpia dedicada bajo una campana de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) equipada con luz UV o un gabinete de bioseguridad con el flujo de aire apagado. Extienda papel de aluminio estéril a través de la mesa de trabajo para atrapar cualquier polvo / fragmento de hueso perdido. Asegúrese de que todos los fragmentos óseos se recuperen (para su repatriación) antes de desechar la lámina. Cambie la lámina entre el tratamiento de cada elemento esquelético. Deseche la lámina usada en una bolsa/recipiente de riesgo biológico esterilizable en autoclave. Retire la mayor cantidad posible de suciedad/detritus sueltos de los lugares de muestreo anatómico limpiando suavemente el área con una toallita estéril seca sin pelusa (consulte la Tabla de materiales). Deseche las toallitas en bolsas o recipientes de riesgo biológico esterilizables en autoclave. Descontamine la superficie limpia limpiando con una toallita estéril humedecida con lejía comercial diluida (~0.01% v / v, diluido con agua ultrapura libre de DNasa / RNasa) y deje incubar durante 5 min. Deseche las toallitas en bolsas o recipientes de riesgo biológico esterilizables en autoclave.PRECAUCIÓN: La lejía es un producto químico altamente corrosivo y reactivo; por lo tanto, deben tomarse las precauciones de seguridad adecuadas antes de su uso. Retire la mayor cantidad posible de lejía residual del lugar de muestreo anatómico con una toallita estéril humedecida con agua ultrapura libre de DNasa/RNasa. Deseche las toallitas en bolsas o recipientes de riesgo biológico esterilizables en autoclave. Exponga todos los lugares de muestreo anatómico limpios a la radiación UV durante 30 minutos (longitud de onda: 254 nm) y luego deje que se sequen completamente a temperatura ambiente. Asegúrese de que los lugares de muestreo anatómico estén completamente secos antes de proceder con el muestreo o regresar al almacenamiento no solo para facilitar la generación de polvo óseo, sino también para evitar una mayor degradación de la muestra (por ejemplo, moho).PRECAUCIÓN: La exposición a la radiación UV puede ser perjudicial para los ojos. Pasar inmediatamente al muestreo o almacenar los elementos óseos en un ambiente estéril seco y con temperatura controlada (25 °C). 3. Generación de polvo óseo NOTA: Los siguientes protocolos están destinados a su uso en la extracción de ADN siguiendo el protocolo26 de Dabney et al. 2019. Muestreo de pars petrosaNOTA: Este protocolo está adaptado de los procedimientos descritos en Pinhasi et al. 20194 y se presenta aquí para facilitar su uso. Este protocolo no representa el método actual y menos destructivo para el muestreo de pars petrosa. Como tal, se recomienda utilizar el protocolo descrito por Sirak et al. 201713 o Orfanou et al. 202014 para muestras cuya preservación morfológica sea de máxima importancia.Realice todas las tomas de muestras en una sala limpia dedicada bajo una campana de PCR equipada con luz UV o un gabinete de bioseguridad (longitud de onda: 254 nm) con el flujo de aire apagado. Extienda papel de aluminio estéril a través de la mesa de trabajo para atrapar cualquier polvo / fragmento de hueso perdido. Asegúrese de que todos los fragmentos óseos y la mayor cantidad de polvo posible se recuperen (para la repatriación) antes de desechar el papel de aluminio. Cambie la lámina entre cada muestreo. Deseche la lámina usada en una bolsa/recipiente de riesgo biológico esterilizable en autoclave. Asegure el elemento seco y descontaminado con una abrazadera o tornillo esterilizado. Corte la pars petrosa por la mitad a lo largo del surco petroso superior (ver Figura 1) usando una sierra de joyero estándar equipada con una hoja de 0.6 mm (ver Tabla de materiales) a velocidad media para evitar el sobrecalentamiento (ver NOTA debajo del paso 3.1.6).PRECAUCIÓN: La pars petrosa es muy densa y, como tal, puede ser difícil de cortar. Tenga cuidado de mantener el elemento firmemente sujeto para evitar lesiones. Deseche las hojas de sierra rotas en el recipiente de los objetos punzantes apropiados. Retire las porciones petrosas de la abrazadera. Recupere y guarde cualquier material suelto / excedente. Coloque el papel de pesaje en un bote de pesaje estéril Sostenga la parte petrosa sobre el papel de pesaje, corte el lado inclinado hacia la bandeja de pesaje. Perfore el hueso cortical denso entre el canal facial y el antro mastoideo (parece más brillante que el material circundante, consulte la Figura 1) utilizando un taladro dental equipado con una broca de calibre pequeño (consulte la Tabla de materiales) y ajustado a velocidad media, torsión media para producir polvo óseo.NOTA: La perforación / corte debe hacerse en ráfagas cortas a velocidades bajas a medias para evitar el sobrecalentamiento del hueso y potencialmente destruir / dañar el ADN. Como anécdota, cuando la porción densa del petroso comienza a sobrecalentarse, se puede observar un olor descrito como tocino de cocción. Deje de taladrar/aserrar inmediatamente y deje que el hueso descanse hasta que se enfríe lo suficiente antes de reanudarlo. Repita la perforación hasta que se recojan aproximadamente 50-100 mg de polvo en el papel de pesaje, medido con una balanza adjunta con una precisión de al menos 0,01 mg (consulte la Tabla de materiales).NOTA: Siempre que sea posible, se sugiere reunir 100 mg de polvo óseo para permitir dos extracciones de ADN replicadas de 50 mg cada una. Sin embargo, esto no siempre es posible debido a la limitación de las ubicaciones de muestreo anatómico en sí (por ejemplo, la falange distal, la cámara de la pulpa dental) o la necesidad de preservación morfológica. Para otros lugares, como el cemento, considerablemente menos de 50 mg del material puede estar disponible. Sin embargo, se ha demostrado que el cemento, la cámara de la pulpa dental y la falange distal producen ADN endógeno significativo 11,27,28, a pesar de la menor entrada inicial de polvo óseo del proceso de extracción. Transfiera el polvo del papel de pesaje a un tubo de bloqueo seguro de 2 ml etiquetado como de baja unión para su extracción o almacenamiento. Almacenar las muestras a -20 °C, indefinidamente. Almacene el hueso restante/exceso de polvo en un ambiente estéril seco y con temperatura controlada (25 °C) hasta que se pueda completar la devolución/repatriación. Deseche todos los residuos en bolsas o recipientes de riesgo biológico esterilizables en autoclave. Esterilizar/descontaminar todo el equipo reutilizable (por ejemplo, abrazaderas, brocas, taladros, sierras, etc.) utilizando lejía/solución de descontaminación de ADN/etanol y exposición UV (longitud de onda: 254 nm), según corresponda, entre cada muestreo. Figura 1: Hueso temporal incluyendo la pars petrosa. (A) Muestra de precorte que muestre las ubicaciones de la pirámide petrosa y el surco petrosa. (B) Porción petrosa post-corte resaltando las áreas densas a perforar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Muestreo de molares permanentesNOTA: Para el muestreo de molares permanentes, preseleccionar in situ molares con raíces fusionadas e idealmente sin caries, grietas en el esmalte o desgaste excesivo para obtener mejores resultados. Retire cualquier muestra de cálculo dental y guárdela a -20 °C para posibles análisis futuros del microbioma oral (procedimiento no cubierto aquí).Muestreo del cementoRealice todas las tomas de muestras en una sala limpia dedicada bajo una campana de PCR equipada con luz UV o un gabinete de bioseguridad (longitud de onda: 254 nm) con el flujo de aire apagado. Extienda papel de aluminio estéril a través de la mesa de trabajo para atrapar cualquier polvo / fragmento de hueso perdido. Asegúrese de que todos los fragmentos óseos y la mayor cantidad de polvo posible se recuperen (para su repatriación) antes de desechar el papel de aluminio. Cambie la lámina entre cada muestreo. Deseche la lámina usada en una bolsa/recipiente de riesgo biológico esterilizable en autoclave. Coloque una hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estéril. Sujete/asegure el molar descontaminado por el esmalte, con la raíz hacia abajo, sobre una bandeja de pesaje utilizando una abrazadera de mano, como una llave ajustable (consulte la Tabla de materiales). Equipe un taladro dental con una rueda de corte circular con bordes de diamante. Con el taladro ajustado a un ajuste de velocidad / par medio, toque ligeramente el borde de la broca hasta la raíz en un ángulo de aproximadamente -20 °. Raspa hacia abajo en la bandeja para quitar/recoger el material amarillo más externo de la raíz (cemento). Detenga la recolección cuando el material más claro (blanco) de la dentina se haga visible.NOTA: Es importante hacer coincidir la dirección de rotación de la broca de corte en relación con la bandeja de recolección para evitar que el polvo se aerosolice y potencialmente desperdicie la muestra al perder la bandeja por completo. El cemento es particularmente rico en ADN; Sin embargo, los rendimientos típicos del material son mucho menores que otros lugares de muestreo anatómico (~7-20 mg)11,27,28. Registre la masa de polvo recolectado en papel de pesaje utilizando una balanza cerrada con una precisión de al menos 0,01 mg (consulte la Tabla de materiales). Transfiera el polvo del papel de pesaje a un tubo de bloqueo seguro y de baja unión de 2 ml para su extracción. Conservar a -20 °C, indefinidamente. Muestreo de la cámara pulparDespués de que se haya recolectado el cemento (si se desea), seccionar el molar a lo largo de la unión cemento-esmalte usando una sierra de joyero para quitar la corona (ver Figura 2). Coloque una nueva hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje nueva. Fije la sección de la corona en una abrazadera o tornillo de mano, sobre la bandeja de pesaje. Mantenga el lado cortado inclinado hacia abajo y perfore / raspe el material como primera pasada con un taladro dental equipado con una broca de perforación de calibre pequeño (consulte la Tabla de materiales) a lo largo de los bordes de la cámara de pulpa dentro de la parte de la corona (consulte la figura 2).NOTA: Solo el primer paso del interior de la cámara pulpar debe recolectarse y etiquetarse como material pulpar (rendimiento típico de 5-15 mg), cualquier cosa más profunda en el diente se considera dentina. Gire el diente con la parte inferior hacia abajo, golpee la abrazadera con un martillo y recoja el polvo liberado en el papel de pesaje. Registre el peso del polvo recogido en el papel de pesaje utilizando una balanza adjunta con una precisión de al menos 0,01 mg (consulte la Tabla de materiales). Transfiera el polvo del papel de pesaje a un tubo de bloqueo seguro de 2 ml de baja unión para su extracción. Conservar a -20 °C, indefinidamente. Muestreo de la dentinaColoque una nueva hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje nueva. Sujete la sección de la corona sobre la bandeja de pesaje (según el paso 3.2.2.3), perfore y recoja otros 50-100 mg de dentina medidos utilizando una balanza cerrada con una precisión de 0,01 mg (ver Tabla de materiales) desde el interior de la cámara pulpar de la misma manera para un muestreo adicional de dentina (ver Figura 2). Transfiera el polvo óseo del papel de pesaje a un tubo de bloqueo seguro de 2 ml de baja unión para su extracción. Conservar a -20 °C, indefinidamente. Almacene las piezas dentales restantes/el exceso de polvo en un ambiente estéril seco y con temperatura controlada (25 °C) hasta que se pueda completar la devolución/repatriación. Deseche todos los residuos en bolsas o recipientes de riesgo biológico esterilizables en autoclave. Esterilice / descontamine todo el equipo reutilizable (por ejemplo, abrazaderas, brocas, taladros, sierras, etc.) utilizando lejía / solución de descontaminación de ADN / etanol y exposiciones UV (longitud de onda: 254 nm) según corresponda, entre cada muestreo. Figura 2: Premuestreo molar permanente. (A) Molar pretratado antes del muestreo, mostrando corona, cemento (capa amarillenta de la raíz) y el sitio de corte en la unión cemento-esmalte. (B) La misma colección molar post-cemento, mostrando el sitio de corte en la unión cemento-esmalte. (C) Postcorte molar y muestreo que muestra las ubicaciones de muestreo anatómico para la cámara de la pulpa dental y la dentina dentro de la corona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Muestreo de las vértebras torácicasMuestreo del cuerpo vertebralRealice todas las tomas de muestras en una sala limpia dedicada bajo una campana de PCR equipada con luz UV o un gabinete de bioseguridad (longitud de onda: 254 nm) con el flujo de aire apagado. Extienda papel de aluminio estéril a través de la mesa de trabajo para atrapar cualquier polvo / fragmento de hueso perdido. Asegúrese de que todos los fragmentos óseos y la mayor cantidad de polvo posible se recuperen (para su repatriación) antes de desechar el papel de aluminio. Cambie la lámina entre cada muestreo. Deseche la lámina usada en una bolsa/recipiente de riesgo biológico esterilizable en autoclave. Coloque una pequeña hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estándar. Asegure las vértebras con una pinza o una visera de mano, con el cuerpo vertebral hacia afuera. Sostenga las vértebras sobre la bandeja de pesaje con el cuerpo vertebral inclinado hacia abajo. Usando un taladro dental equipado con una broca de perforación de calibre pequeño (consulte la Tabla de materiales) ajustada a un par alto de baja velocidad, perfore a lo largo del borde más externo (inferior y superior) del hueso cortical que rodea el tejido interno esponjoso del cuerpo vertebral (consulte la figura 3). Raspa la broca contra la capa cortical sobre una bandeja de ponderación estándar hasta que se recojan 50-100 mg de material, medido con una balanza cerrada con una precisión de 0,01 mg (ver Tabla de materiales). Transfiera el polvo óseo del papel de pesaje a un tubo de bloqueo seguro y de baja unión de 2 ml para su extracción. Conservar a -20 °C, indefinidamente. Muestreo del arco vertebral superiorNOTA: Este paso es opcional. Retire y deseche la capa más externa del hueso cortical del arco vertebral superior utilizando un taladro dental equipado con una broca de perforación de calibre pequeño (ver Tabla de materiales) raspándola a lo largo de la superficie19. Esto no se sugiere para el muestreo del cuerpo vertebral, ya que la capa de hueso cortical es generalmente muy delgada y es probable que se agote por completo por este proceso (ver NOTA en la sección 2).Coloque una pequeña hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estándar. Asegure las vértebras en una abrazadera / tornillo de mano con el proceso vertebral hacia afuera, aspecto superior hacia abajo. Mientras sostiene las vértebras, aspecto superior hacia abajo, sobre una bandeja de pesaje, perfore hacia arriba en el centro de la muesca en forma de V formada por la fusión del proceso espinoso con las laminillas (ver Figura 3) usando un taladro dental con una broca de calibre pequeño (ver Tabla de materiales) ajustada a baja velocidad y alto torque. Deje de perforar cuando haya una caída notable en la resistencia. Cambie ligeramente la posición de perforación y repita hasta que se recojan 50-100 mg de polvo óseo, medido con una balanza cerrada con una precisión de 0,01 mg (consulte la Tabla de materiales). Transfiera el polvo óseo del papel de pesaje a un tubo de baja unión de 2 ml para su extracción. Conservar a -20 °C, indefinidamente. Almacene el hueso restante/exceso de polvo en un ambiente estéril seco y con temperatura controlada (25 °C) hasta su devolución/repatriación. Deseche todos los residuos en bolsas o recipientes de riesgo biológico esterilizables en autoclave. Esterilice / descontamine todo el equipo reutilizable (por ejemplo, abrazaderas, brocas, taladros, sierras, etc.) utilizando lejía/solución de descontaminación de ADN/etanol y exposición UV (longitud de onda: 254 nm), según corresponda, entre cada muestreo. Figura 3: Ubicaciones de muestreo anatómico del hueso cortical del cuerpo vertebral y del arco vertebral superior de la vértebra torácica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Muestreo de la falange distalNOTA: Este paso es opcional. Retire y deseche la capa más externa del hueso cortical del eje y/o del mechón apical utilizando un taladro dental equipado con una broca de perforación de pequeño calibre raspándola a lo largo de la superficie19. Esto puede no ser posible para muestras con hueso cortical excesivamente delgado o restos juveniles (ver NOTA en la sección 2).Realice todas las tomas de muestras en una sala limpia dedicada, bajo una campana de PCR equipada con luz UV o un gabinete de bioseguridad (longitud de onda UV: 254 nm) con el flujo de aire apagado. Extienda papel de aluminio estéril a través de la mesa de trabajo para atrapar cualquier polvo / fragmento de hueso perdido. Asegúrese de que todos los fragmentos óseos y la mayor cantidad de polvo posible se recuperen (para su repatriación) antes de desechar el papel de aluminio. Cambie la lámina entre cada muestreo. Deseche la lámina usada en una bolsa/recipiente de riesgo biológico esterilizable en autoclave. Coloque una pequeña hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estándar. Asegure la muestra en abrazadera/tornillo de mano, lado superior hacia arriba. Sostenga la muestra sobre la bandeja de pesaje, recoja el polvo óseo del hueso cortical del lado inferior del mechón apical y el eje perforando a través de las capas densas más externas (véase la figura 4) utilizando un taladro dental equipado con una broca de perforación de calibre pequeño (consulte la Tabla de materiales). Deje de perforar cuando haya una marcada disminución de la resistencia, ya que esto significa un material más ligero y esponjoso. Repita este proceso, irradiando hacia afuera desde la perforación inicial hasta que se recojan al menos 50-100 mg de polvo óseo, medido con una balanza cerrada con una precisión de 0,01 mg (consulte la Tabla de materiales). Transfiera el polvo óseo del papel de pesaje a un tubo de bloqueo seguro de 2 ml de baja unión para su extracción. Conservar a -20 °C, indefinidamente. Almacene el hueso restante/exceso de polvo en un ambiente estéril seco y con temperatura controlada (25 °C) hasta su devolución/repatriación. Deseche todos los residuos en bolsas o recipientes de riesgo biológico esterilizables en autoclave. Esterilizar/descontaminar todo el equipo reutilizable (p. ej., abrazaderas, brocas, taladros, sierras, etc.) utilizando lejía/solución de descontaminación de ADN/exposición al etanol y a los rayos UV, según corresponda, entre cada muestreo.NOTA: Para muestras más pequeñas (por ejemplo, muestras juveniles) puede haber considerablemente menos de los 50-100 mg de hueso cortical sugeridos disponibles para la muestra. Sin embargo, incluso en cantidades bajas, se ha demostrado que esta ubicación de muestreo anatómico es particularmente rica en ADN11. Figura 4: Falange distal que muestra las ubicaciones del hueso cortical denso a lo largo del eje y el lado inferior del mechón apical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Muestreo del astrágaloRealice todas las tomas de muestras en una sala limpia dedicada bajo una campana de PCR equipada con luz UV o un gabinete de bioseguridad (longitud de onda: 254 nm) con el flujo de aire apagado. Extienda papel de aluminio estéril a través de la mesa de trabajo para atrapar cualquier polvo / fragmento de hueso perdido. Asegúrese de que todos los fragmentos óseos y la mayor cantidad de polvo posible se recuperen (para su repatriación) antes de desechar el papel de aluminio. Cambie la lámina entre cada muestreo. Deseche la lámina usada en una bolsa/recipiente de riesgo biológico esterilizable en autoclave. Coloque una pequeña hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estándar. Asegure la muestra en una abrazadera/tornillo de mano, cúpula hacia arriba. Sostenga el astrágalo, la cúpula hacia arriba y la superficie medial hacia el colector, sobre la bandeja de pesaje. Raspa el hueso cortical del cuello del astrágalo a una profundidad de ~1 mm (ver Figura 5) usando un taladro dental con una broca de calibre bajo (ver Tabla de materiales) ajustada a baja velocidad y alto torque. Cambie ligeramente la posición de perforación y repita hasta que se recojan aproximadamente 50-100 mg de polvo óseo, medido con una balanza cerrada con una precisión de 0,01 mg (consulte la Tabla de materiales). Transfiera el polvo óseo del papel de pesaje a un tubo de baja unión de 2 ml para su extracción. Conservar a -20 °C, indefinidamente. Almacene el hueso restante/exceso de polvo en un ambiente estéril seco y con temperatura controlada (25 °C) hasta que se pueda completar la devolución/repatriación. Deseche todos los residuos en bolsas o recipientes de riesgo biológico esterilizables en autoclave. Esterilizar/descontaminar todo el equipo reutilizable (por ejemplo, abrazaderas, brocas, taladros, sierras, etc.) utilizando lejía/solución de descontaminación de ADN/etanol y exposición UV (longitud de onda: 254 nm), según corresponda, entre cada muestreo. Figura 5: Área de muestreo del astrágalo para la recuperación del hueso cortical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. NOTA: El astrágalo tiene muy poco hueso cortical (una capa externa delgada). El material no solo debe recogerse de la superficie, sino también de la capa densa subyacente de hueso esponjoso.