Generering af nullmutanter for at belyse rollen som bakterielle glycosyltransferaser i bakteriel motilitet

Proteinglykosylering er beskrevet i både gram-positive og gram-negative bakterier og består af den kovalente fastgørelse af en glycan til en aminosyresidekæde ^1,2. I prokaryoter forekommer denne proces normalt via to store enzymatiske mekanismer: O- og N-glycosylering³. Ved O-glycosylering er glycanen bundet til hydroxylgruppen af en serin (Ser) eller threonin (Thr) rest. Ved N-glycosylering er glycanen bundet til sidekædeamidnitrogenet af en asparagin (Asn) rest inden for tripeptidsekvenserne Asn-X-Ser / Thr, hvor X kunne være enhver aminosyre undtagen prolin.

Glycaner kan vedtage lineære eller forgrenede strukturer og er sammensat af monosaccharider eller polysaccharider kovalent bundet af glycosidbindinger. I prokaryoter viser glycaner normalt mangfoldighed i sukkersammensætning og struktur i forhold til eukaryote glycaner⁴. Desuden er to forskellige bakterielle glykosyleringsveje, der adskiller sig i, hvordan glycanen samles og overføres til acceptorproteinet, blevet beskrevet: sekventiel og en bloc glycosylering ^5,6. Til sekventiel glykosylering opbygges den komplekse glycan direkte på proteinet ved successiv tilsætning af monosaccharider. I en blokglykosylering overføres en færdigmonteret glycan til proteinet fra et lipidbundet oligosaccharcharid ved hjælp af en specialiseret oligosaccharyltransferase (OTase). Begge veje har vist sig at være involveret i N- og O-glycosyleringsprocesser⁷.

Proteinglykosylering har en rolle i moduleringen af proteiners fysisk-kemiske og biologiske egenskaber. Tilstedeværelsen af en glycan kan påvirke, hvordan proteinet interagerer med dets ligand, hvilket påvirker proteinets biologiske aktivitet, men kan også påvirke proteinstabilitet, opløselighed, modtagelighed for proteolyse, immunogenicitet og mikrobe-værtsinteraktioner ^8,9. Imidlertid kan flere glykosyleringsparametre, såsom antallet af glycaner, glycansammensætning, position og fastgørelsesmekanisme, også påvirke proteinfunktion og struktur.

Glycosyltransferaser (GT’er) er de vigtigste enzymer i biosyntesen af komplekse glycaner og glycokonjugater. Disse enzymer katalyserer den glykosidiske bindingsdannelse mellem en sukkermoiety fra et aktiveret donormolekyle og en specifik substratacceptor. GT’er kan anvende både nukleotider og ikke-nukleotider som donormolekyler og målrette mod forskellige substratacceptorer, såsom proteiner, saccharider, nukleinsyrer og lipider¹⁰. Derfor er det vigtigt at forstå GT’er på molekylært niveau for at identificere deres virkningsmekanismer og specificitet og muliggør også forståelse af, hvordan sukkersammensætningen af glycaner, der ændrer relevante molekyler, er relateret til patogenicitet. Carbohydrate Active Enzyme Database (CAZy)¹¹ klassificerer GT’er i henhold til deres sekvenshomologi, hvilket giver et prædiktivt værktøj, da den strukturelle fold og virkningsmekanismer i de fleste GT-familier er invariante. Fire grunde gør det imidlertid vanskeligt at forudsige substratspecikaliteten for mange GT’er: 1) der er ikke bestemt noget klart sekvensmotiv, der bestemmer substratspecikaliteten i prokaryoter¹², 2) mange GT’er og OTaser viser substratpromiskuitet ^13,14, 3) funktionelle GT’er er vanskelige at producere i højt udbytte i rekombinant form, og 4) identifikationen af både donor- og acceptorsubstrater er kompleks. På trods af dette har nylige mutageneseundersøgelser gjort det muligt at opnå betydelige fremskridt i forståelsen af katalytiske mekanismer og trække binding af GT’er.

I bakterier synes O-glycosylering at være mere udbredt end N-glycosylering. O-glycosyleringsstederne viser ikke en konsensussekvens, og mange af de O-glycosylerede proteiner udskilles eller celleoverfladeproteiner, såsom flagelliner, pili eller autotransportører¹. Flagellinglykosylering viser variation i antallet af acceptorsteder, glykansammensætning og struktur. For eksempel har Burkholderia spp flagelliner kun et acceptorsted, mens flagelliner i Campylobacter jejuni har så mange som 19 acceptorsteder^15,16. Desuden er glycan for nogle bakterier et enkelt monosaccharid, mens andre bakterier besidder heterogene glycaner kompromitteret af forskellige monosaccharider for at danne oligosaccharider. Denne heterogenicitet forekommer selv blandt stammer af samme art. Helicobacter flagelliner er kun modificeret af pseudaminsyre (PseAc)¹⁷, og Campylobacter flagelliner kan modificeres af PseAc, acetamidinoformen af pseudaminsyre (PseAm) eller legionaminsyre (LegAm) og glycaner afledt af disse sukkerarter med acetyl, N-acetylglucosamin eller propioniske substitutioner^18,19. I Aeromonas modificeres flagelliner af glycaner, hvis sammensætning spænder fra et enkelt PseAc-syrederivat til et heteropolysaccharid²⁰, og fastgørelsen af glycaner til flagellinmonomererne sker altid via et PseAc-derivat.

Generelt er glykosylering af flagelliner afgørende for flagellar filamentsamling, bevægelighed, virulens og værtssotientitet. Men mens flagelliner af C. jejuni¹⁶, H. pylori^{17 og} Aeromonas sp. ²¹ kan ikke samles i filament, medmindre proteinmonomererne er glykosylerede, Pseudomonas spp. og Burkholderia spp. ¹⁵ kræver ikke glykosylering til samling af flageller. Desuden påvirker ændringer i flagellaglycanens sukkersammensætning i nogle C. jejuni-stammer bakterie-værtsinteraktion og kan spille en rolle i at undgå visse immunresponser¹⁶. Autoagglutination er en anden fænotypisk egenskab påvirket af ændringer i sammensætningen af glycaner forbundet med flagelliner. En lavere autoagglutination fører til en reduktion i evnen til at danne mikrokolonier og biofilm²². I nogle bakterier var flagellas evne til at udløse et proinflammatorisk respons forbundet med flagellinglykosylering. I P. aeruginosa inducerer glycosyleret flagellin således et højere proinflammatorisk respons end unglycosyleret²³.

Aeromonas er gramnegative bakterier, der er allestedsnærværende i miljøet, hvilket gør det muligt for dem at være ved grænsefladen mellem alle One Health-komponenter ²⁴. Mesophilic Aeromonas har et enkelt polært flagellum, som er konstitutivt produceret. Mere end halvdelen af kliniske isolater udtrykker også lateral flagellin, der kan induceres i medier eller plader med høj viskositet. Forskellige undersøgelser har relateret begge flagellatyper med de tidlige stadier af bakteriel patogenese²⁵. Mens polære flagelliner, der er rapporteret til dato, er O-glycosyleret ved 5-8 Ser- eller Thr-rester af dets centrale immunogene domæner, er laterale flagelliner ikke O-glycosyleret i alle stammerne. Selvom polære flagellaglycaner fra forskellige stammer viser mangfoldighed i deres kulhydratsammensætning og kædelængde²⁰, har det bindende sukker vist sig at være et pseudaminsyrederivat.

Målet med dette manuskript er at beskrive en metode til opnåelse af nulmutanter i specifikke GT’er eller kromosomale regioner indeholdende GT’er for at analysere deres involvering i biosyntesen af relevante polysaccharider og i bakteriel patogenicitet samt selve glycanens rolle. Som et eksempel identificerer og sletter vi en kromosomal region, der indeholder GT’er af Aeromonas for at fastslå dets involvering i polær flagellinglykosylering og analysere flagellinglycanens rolle. Vi viser, hvordan man sletter en bestemt GT for at etablere dens funktion i biosyntesen af denne glycan og rollen som modificeret glycan. Selvom man bruger Aeromonas som et eksempel, kan princippet bruges til at identificere og studere flagellaglykosyleringsøer af andre gramnegative bakterier og analysere funktionen af GT’er involveret i biosyntesen af andre glycaner såsom O-antigen lipopolysaccharid.