肌动蛋白动力学、离合器耦合和牵引力分析，促进生长锥体前进

所有使用实验动物的实验均由奈良科学技术研究所的机构动物护理和使用委员会进行。研究者应遵循其机构和国家动物监管委员会制定的关于照料和使用实验动物的指南。 1. 溶液和培养基的制备 准备补充文件 1 中总结的解决方案和培养基 2. 聚-D-赖氨酸（PDL）/层粘连蛋白包覆基材的制备 用100μg/ mL PDL包覆14 mm直径的玻璃底培养皿，溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中，并在37°C的加湿培养箱中孵育过夜。注意：在此步骤后，请勿使玻璃表面干燥 取出PDL溶液，在玻璃杯上移取1 mL PBS三次，持续10秒。 用5μg/ mL层粘连蛋白涂覆培养皿，溶解在PBS中，并在37°C的加湿培养箱中孵育过夜。 取出层粘连蛋白溶液，在玻璃杯上移液1毫升PBS，持续10秒，每次三次。 取出PBS并将0.5 mL神经基质培养基放在玻璃表面上。将培养皿储存在37°C的加湿培养箱中。注意：PDL / 层粘连蛋白包被的培养皿可以在37°C的加湿培养箱中储存2-3天。 3. 海马体的解剖和解离 通过颈椎脱位对怀孕的小鼠实施安乐死。注：本研究使用市售小鼠（ 见材料表）。研究人员应该使用在无菌环境中繁殖和人道处理的小鼠。 解剖胚胎16天（E16）小鼠胚胎，并将它们放在冰上。 在层流罩中，用剪刀解剖大脑，并将其放在含有10 mL冰冷解剖溶液的无菌10厘米培养皿中。 用体视显微镜解剖，小心地剥离大脑半球的脑膜，然后用镊子解剖海马。 将海马转移到15 mL管中的5 mL冰冷消化液中。将海马体在37°C的水浴中孵育20分钟。 取出消化液并加入3mL解剖溶液。 用巴斯德移液器轻轻移液海马体四次。 将海马体在37°C的水浴中孵育20分钟。 将细胞悬浮液转移到50mL离心管中。向未解离的组织加入3mL新的解剖溶液。 重复步骤3.7-3.9，直到海马完全解离。 通过旋转并用巴斯德移液管吸气从细胞悬浮液中除去漂浮的DNA聚集体。在4°C下以180× g 离心细胞悬浮液20分钟。注意：来自受损细胞的DNA会干扰离心过程。如果神经元保留在上清液中，请在小心地除去DNA后再次离心细胞悬浮液。 在37°C和5%CO 2的加湿培养箱中平衡含有10%胎牛血清（FBS），青霉素（100U / mL）和链霉素（100μg/ mL）的神经基础培养基。 4. 转染和培养神经元 取出上清液，将5 mL冰冷的PBS加入50 mL管中。通过轻柔移液重悬细胞沉淀。 将10μL细胞悬浮液转移到微量离心管中，加入10μL0.5%台盼蓝溶液，然后用血细胞计数器计数细胞数。 在4°C下以180× g 离心50mL管中的细胞悬浮液20分钟。 同时，将转染等分试样，每1×10 6 个细胞1μgpFN21A-HaloTag-actin和3μgpmNeonGreen-N1-Lifeact放入微量离心管中。 离心后，除去上清液，将100μL电穿孔培养基（由转染试剂盒提供）加入50mL管中。通过移液重悬细胞沉淀。 将细胞悬浮液与等分的DNA溶液混合，并将混合物转移到比色皿（由转染试剂盒提供）。注意：由于气泡会干扰电穿孔，因此请将其从电池悬浮液中取出。 将比色皿插入电穿孔装置（材料表），并使用程序O-005进行电穿孔。 立即将1mL含有10S，青霉素（100 U / mL）和链霉素（100μg/ mL）的预热和平衡的神经基础培养基加入比色皿中。 使用塑料移液管（由转染试剂盒提供）将细胞悬浮液转移到15 mL离心管中。 将10μL细胞悬浮液转移到微量管中，加入10μL0.5%台盼蓝溶液，然后用血细胞计数器计数细胞数量。 从培养箱中取出PDL /层粘连蛋白涂层的玻璃底培养皿，并取出神经基底培养基。 移液0.5mL细胞悬浮液，每培养皿含有2.0×105 个细胞，并在37°C的加湿培养箱中孵育5%CO 3 小时。 用含有2%B-27补充剂，谷氨酰胺（1mM），青霉素（100 U / mL）和链霉素（100μg/ mL）的0.5mL神经基础培养基代替培养基。将神经元在37°C下用5%CO 2在加湿的培养箱中培养3天。 5. 神经元生长锥体的单斑点成像 在体外日（DIV）3上，用四甲基罗丹明（TMR）配体在培养基中以1：2000稀释的稀释度处理神经元。将神经元在37°C下用5%CO 2维持1小时。 用预热的PBS洗涤TMR配体三次。 取出PBS和移液器0.5毫升温热的Leibovitz的L-15培养基，其中含有2%B-27补充剂，谷氨酰胺（1mM），青霉素（100 U / mL）和链霉素（100μg/ mL）。 在37°C下维持神经元1小时。 打开落射荧光显微镜，将台顶培养箱设置为37°C。注：本实验方案使用落射荧光显微镜，配备互补金属氧化物半导体相机、100x/1.40 NA油浸物镜、汞灯和图像采集软件（见 材料表）。其他具有相同规格的落射荧光显微镜也可用于此分析。 将TMR配体处理的神经元置于加热的舞台顶部培养箱上的玻璃底培养皿中。 设置图像采集参数如下：曝光时间，Lifeact和HaloTag-actin荧光通道500 ms;合并，1 x 1（每像素 0.065 μm × 0.065 μm）;时间间隔， 3 秒;持续时间，50 帧。 选择强烈表达Lifeact并弱表达HaloTag-actin的生长锥体。注意：Lifeact表达应足够强烈，以可视化生长锥形形态。HaloTag-actin表达应弱，不足以被检测到（图2A）。荧光蛋白表达的水平可以通过改变用于转染的DNA量来调节。 关闭隔膜的磁场以照亮包括生长锥在内的最小区域（图2B）。注：最小区域的照明会降低背景信号并增加荧光信噪比（S/ N），从而能够检测肌动蛋白斑点（图2B）。为了进一步提高信噪比，建议使用中性密度滤光片照亮生长锥而不减少光线。 采集延时摄影图像（补充文件 2）。另存为多通道延时堆栈图像（tiff 格式）。 6. 使用斐济图像处理和分析软件定量 F-肌动蛋白流速和聚合速率 注：请参阅 补充文件3 ，了解量化F-肌动蛋白流速和肌动蛋白聚合速率的实践数据。 在斐济上打开多通道延时堆栈图像。 选择 “分析>设置比例”，然后设置图像的像素大小。 找到一个在丝状体或薄片状体的F-肌动蛋白束内逆行流动至少五个时间范围内的肌动蛋白斑点。 选择” 图像>变换>旋转”，然后调整图像的角度，使F-肌动蛋白束指向上方（图3A）。 单击工具栏上的 矩形 ，然后绘制一个包含肌动蛋白斑点和F-actin束尖端的框（图3B，1和2）。注意：HaloTag-actin斑点的信号很弱。此外，生长锥远端的Lifeact信号微弱且微弱（图2B），因为生长锥的远端与近端部分相比很薄。研究人员应增强信号以优化F-肌动蛋白流速和聚合速率的定量（图3B）。虽然近端生长锥体处的Lifeact信号变得饱和，但这不会干扰F-actins远端的测定（图3E，黄线）。 选择 “图像>复制 “，然后输入五个时间范围（图 3B，3-5）。 选择 图像>堆栈>制作蒙太奇，并输入参数：列，5;行， 1;比例因子， 1. 单击 “确定”。图像蒙太奇将出现在屏幕上。 选择 “图像>颜色>拆分通道”。这将分隔两个荧光通道。 F-肌动蛋白流速的定量。 选择 分析>设置测量值，然后选择 面积 和 边界矩形。 单击工具栏上的 椭圆形 ，然后在肌动蛋白斑点上画一个圆圈（图3C，1和2）。 选择” 图像>叠加”>添加所选内容。圆圈叠加在图像蒙太奇上（图3C，3和4）。注：叠加层的颜色可以在 “编辑>选项”>颜色”中更改。 对剩余的斑点重复圆圈的叠加（图3C，5）。注意：为了准确确定肌动蛋白斑点的中心，研究人员应在斑点上叠加圆圈。 单击工具栏上的” 直线 “，然后绘制一条链接圆圈中心的线（图 3D、1 和 2）。 选择” 分析>度量”。结果将出现在屏幕上（图3D，3）。注：结果中显示 的高度 表示观察期间肌动蛋白斑点的易位距离（图3D，3）。 通过将易位距离除以观察时间来计算F-肌动蛋白流速。 F-肌动蛋白聚合速率的定量。 画一条连接F-肌动蛋白束尖端的线（图3E，1）。 选择” 分析>度量”。结果将出现在屏幕上（图3E，2）。注意： 结果中的高度 表示观察期间F-肌动蛋白束的延伸长度（图3E，2）。 通过将延伸长度除以观察时间来计算 F-肌动蛋白延伸率。 计算F-肌动蛋白聚合速率作为F-肌动蛋白流速和延伸速率之和（图3F）。 7. 用于牵引力显微镜和神经元培养的PAA凝胶的制备 制备牵引力显微镜所需的PAA凝胶（图4） 移取0.5毫升NaOH（100米M），溶于蒸馏H2 O中，在直径为27毫米的玻璃底培养皿中，在室温（RT）下孵育15分钟。 将50μL3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）加入培养皿上的NaOH溶液中，并通过温和移液混合溶液，并在室温下孵育15分钟。 用蒸馏的H 2 O清洗玻璃底盘子，然后晾干。 移取0.5mL的0.5%戊二醛溶液，溶解在PBS中，在APTMS处理的玻璃底培养皿上，并在室温下孵育30分钟。 用蒸馏的H 2 O清洗玻璃底盘子并晾干。 制备含有蒸馏H2O（412μL），30%（w / v）丙烯酰胺溶液（63μL），2.5%（w / v）双丙烯酰胺溶液（6μL）和羧酸盐修饰微球（荧光珠）溶液（20μL）的溶液。注意：在加入丙烯酰胺溶液之前，涡旋荧光珠溶液以解离聚集的珠子。 在真空室中在室温下对溶液进行30分钟的脱气。 加入1μL溶解在蒸馏H2O中的10%（w / v）过硫酸铵（APS）和1μLN，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED），并通过轻柔移液混合。 将玻璃盖玻片（直径18毫米）放在15 mL离心管的盖子上。 立即向盖玻片中加入25μL溶液，然后轻轻地将倒置的玻璃底皿放在盖玻片上。让丙烯酰胺在室温下聚合1小时。 将蒸馏的H2 O涂在盖玻片上，并使用带有弯曲尖端的注射器针头将其从凝胶中剥离出来。 除去H2 O，将溶解在PBS中的磺基-SANPAH（1mM）加入凝胶中。 在无菌条件下，将凝胶暴露在紫外线下5分钟。每次洗涤用PBS洗涤凝胶三次15分钟。 用微球压痕法测定凝胶刚度（图5A）44。 将直径和密度指定的微球转移到凝胶中，然后将其放置在激光扫描共聚焦显微镜的标本台上。 聚焦在凝胶表面并记录z位置（图5B）。 同样，聚焦在微球的底部，并记录z位置（图5C）。 计算压痕深度，由凝胶表面的z位置与微球底部之间的差值决定。 通过以下方式计算凝胶的杨氏模量 E ：其中 f 是微球的浮力校正重量， d 是凝胶的压痕深度， r 是微球的半径， v 是泊松比（其值为 0.3，如前所述46）。 用PDL和层粘连蛋白涂覆凝胶，如第2节所述。 如第3节和第4节所述，解剖E16小鼠胚胎，解离海马体，每1.0×106 个细胞用5μgpEGFP-C1转染。在PDL /层粘连蛋白包被的凝胶上接种2.0×105 个细胞。注意：对于牵引力分析，荧光标记细胞的显微成像对于确定生长锥区域是必要的。 8. 神经元生长锥体牵引力显微镜检查 在DIV3上，用0.5mL加热的Leibovitz的L-15培养基替换培养基，其中含有2%B-27补充剂，谷氨酰胺（1mM），青霉素（100 U / mL）和链霉素（100μg/ mL）。将神经元在37°C下维持1小时。 打开激光扫描共聚焦显微镜，将台顶培养箱设置为37°C。注：本研究使用配备63x/1.2 NA水浸物镜和图像采集和分析软件的激光扫描共聚焦显微镜（见 材料表）。 将神经元放在预热的舞台顶部培养箱上的玻璃底培养皿中。 设置图像采集参数如下：扫描大小，512×512像素;扫描区域，1.5-3倍变焦;扫描速度，每帧~1秒;激光波长，561 nm（荧光珠的激发波长）和488 nm（增强绿色荧光蛋白（EGFP）的激发波长）;时间间隔， 3 秒;持续时间，50 帧。 要可视化生长锥形态，请选择强烈表达EGFP的生长锥。 聚焦在凝胶表面上并获取延时图像（图6A 和 补充文件4）。注：对于牵引力分析，请使用两个荧光通道（用于荧光珠和EGFP）和一个明场通道（建议捕获微分干涉对比度（DIC）或相衬图像）。 使用图像处理软件（例如，斐济）生成单通道延时RGB图像堆栈，并将这些图像另存为tiff文件。注意：调查人员还必须保存原始数据，这一点至关重要。 将100μL溶解在蒸馏H 2 O中的10%（w / v）十二烷基硫酸钠（SDS）施加到玻璃底培养皿中，通过从底物释放神经元来放松凝胶底物。将培养皿在37°C下孵育5分钟以稳定温度。注：在牵引力分析期间，未受训练基板中的磁珠图像用于参考原始磁珠位置（图6C）。SDS溶液的应用由于培养箱中的热变化和细胞诱导的变形的松弛而改变了xyz位置。因此，研究人员需要校正焦平面和x-y位置。 聚焦在凝胶表面上，并获取未受训练的底物中珠子的图像（图6B）。 在未受训练的基材中生成磁珠的单通道RGB图像，并将此图像另存为tiff文件。 使用斐济校正珠子图像在未受训练基板中的x-y位置 在斐济，打开未受训练的基质中的珠子图像和荧光珠的延时堆栈图像。 选择 “图像>堆栈>工具>连接”。屏幕上将出现一个对话框（图7A，1）。 分别选择未训练基板中的微珠图像和 Image1 和 Image2中荧光珠的延时堆叠图像（图7A，2）。 单击 “确定”。将未受约束基板中的磁珠图像添加到延时堆栈图像中（图7A，3）。 使用滚动条（图 7B、1、红色框）显示堆栈图像的第二帧（红色箭头）。 > StackReg 中选择插件（图 7B、2）。屏幕上将出现一个对话框（图7B，3）。 从下拉列表中选择 刚体 （图7B，3，红色框），然后单击 确定。然后开始更正 x-y 位置。 使用滚动条显示 x-y 位置校正堆栈图像的第一帧。 选择 “图像>重复 图像”（图7C，1）。屏幕上将出现一个对话框（图7B，2）。 在”范围”中输入 1，取消选择”重复堆栈”（图 7C、2），然后单击”确定”。未受训练基板上的x-y位置校正珠图像将出现在屏幕上（图7C，3）。将此图像另存为 tiff 文件。 牵引力的量化注：此处描述的牵引力分析方法使用 MATLAB 和两个 MATLAB 工具箱，即”图像处理工具箱”和”并行计算工具箱”。调查人员需要在分析之前安装它们。牵引力分析代码是基于 MATLAB 版本 2018a 开发的。因此，必须使用 MATLAB 版本 2018a（或更高版本）进行分析。用于牵引力分析的算法在前面已有描述22。 从 补充文件 5 下载牵引力分析代码 TFM2021。在 MATLAB 中打开 TFM 2021 在 TFM2021 中打开 main.m 并运行它。屏幕上将出现一个图形用户界面（GUI）（图8A）。 单击加载 未训练的基板图像 ，然后在未训练的基板中选择 x-y 位置校正的磁珠图像。 单击加载 荧光珠图像 ，然后选择磁珠的延时堆栈图像。 单击 加载明场图像 ，然后选择明场的延时堆栈图像。 单击 加载 GFP 映像 ，然后选择 EGFP 的延时堆栈映像。 从 GUI 上的下拉列表中选择 GFP （图 8A，红色框）。 单击 ROI 以指定感兴趣的矩形区域 （ROI），包括生长锥，方法是单击 GUI 上显示的单元格图像上的两个点（图 8B）。 单击 GUI 上的 保存 按钮（图 8A，红色箭头）。选定的堆栈图像以及 ROI 将保存在 .mat 文件（MATLAB 格式文件）中。 单击” 现场检测”。屏幕上将出现一个对话框。 在对话框中输入一个值（通常为 50-150）以确定磁珠检测的阈值。单击” 确定” 开始计算。 完成计算后，单击 “绘图轨迹 “以放大在步骤8.12.8中选择的区域，并将检测到的珠子显示为白点（图8C，1）。注：确认磁珠检测（白点）是否与荧光珠重叠。磁珠检测还可以检测背景噪音。要减少这种外部干扰，请更改 Spot 检测处的阈值。此外，在步骤 8.12.13 中手动选择正确的点。 单击 “选择珠子”，然后划定一个多边形区域，该区域在生长锥下包含正确的点。 按 键盘上的回车键。多边形区域内的白点将变为红色（图8C，2）。 单击 GUI 上的 估计力 。然后，输入以下参数的值：像素大小，μm/像素;杨氏模量，在步骤7.2.5处计算的值;泊松比，0.3。 执行 估计力 以启动计算。该软件将自动将计算结果保存在电子表格格式文件中。注：电子表格显示了每个时间帧的 x 分量、y 分量和力大小（图 8D）。请参阅 补充文件 6 ，了解用于量化牵引力的练习数据。