Análisis de la diferenciación celular, la morfogénesis y el patrón durante la embriogénesis del pollo utilizando el ensayo de cuentas empapadas
Summary
El ensayo de perla empapada implica la entrega dirigida de reactivo de prueba en cualquier punto de tiempo de desarrollo para estudiar la regulación de la diferenciación celular y la morfogénesis. Se presenta un protocolo detallado, aplicable a cualquier modelo animal experimental, para preparar tres tipos diferentes de perlas remojadas e implantarlas en el interdigito de un embrión de pollo.
Abstract
Una multitud de programas genéticos se activan durante el desarrollo embrionario que orquesta la diferenciación celular para generar una asombrosa diversidad de células, tejidos y órganos somáticos. La activación precisa de estos programas genéticos está regulada por morfógenos, moléculas difusibles que dirigen el destino celular a diferentes umbrales. Comprender cómo la activación genética coordina la morfogénesis requiere el estudio de las interacciones locales desencadenadas por los morfógenos durante el desarrollo. El uso de perlas empapadas en proteínas o fármacos implantados en distintas regiones del embrión permite estudiar el papel de moléculas específicas en el establecimiento de dedos y otros procesos de desarrollo. Esta técnica experimental proporciona información sobre el control de la inducción celular, el destino celular y la formación de patrones. Por lo tanto, este ensayo de cuentas empapadas es una herramienta experimental extremadamente poderosa y valiosa aplicable a otros modelos embrionarios.
Introduction
Los avances en los mecanismos moleculares que controlan la expresión génica durante el desarrollo embrionario nos han permitido comprender cómo se determina el destino celular. El compromiso con diferentes linajes celulares ocurre una vez que las células comienzan la expresión molecular de los factores de transcripción1. Este patrón de expresión está altamente coordinado en el espacio y el tiempo y, por lo tanto, dirige la formación, el posicionamiento y el patrón de células, tejidos y órganos 1,2,3,4,5. La inducción embrionaria es el proceso por el cual las células se comprometen con linajes específicos estableciendo jerarquías que restringen la potencialidad de las células, que incluso incluyen la generación del plan corporal básico como ocurre con el organizador de Spemann 6,7. El labio dorsal blastoporo induce un segundo eje embrionario en un embrión huésped 8,9. Hoy en día, con la ayuda del injerto y otros experimentos clásicos combinados con enfoques moleculares, se sabe que diferentes factores de transcripción y factores de crecimiento funcionan para dirigir la inducción embrionaria en el organizador de Spemann10. Por lo tanto, la manipulación experimental es una herramienta importante para comprender la diferenciación celular, la morfogénesis y los procesos de modelado durante la embriogénesis.
Curiosamente, en los sistemas embrionarios donde el trasplante de tejidos es difícil o cuando los inductores ya son bien conocidos, los portadores se utilizan para entregar moléculas (por ejemplo, proteínas, productos químicos, toxinas, etc.) para regular la diferenciación celular, la morfogénesis e incluso los patrones. Uno de estos sistemas portadores consiste en implantar perlas empapadas en una molécula específica en cualquier organismo modelo experimental en cualquier punto de tiempo de desarrollo para determinar el efecto de dicho reactivo o dirigir la diferenciación de dicho modelo. Por ejemplo, al implantar perlas empapadas en ácido retinoico (AR) en el brote de la extremidad del ala de pollo, Cheryl Tickle et al. (1985) demostraron que la AR induce la expresión del erizo sónico en la zona de actividad polarizante (ZPA)11,12. La misma estrategia experimental se utilizó para descubrir que la AR controla la asimetría de los somitas y la muerte celular en el brote de la extremidad durante el desarrollo de los dedos y en otras regiones embrionarias de las extremidades 13,14,15. Otros factores, principalmente proteínas (por ejemplo, factores de crecimiento de fibroblastos [FGF], factor de crecimiento transformante beta [TGF-ß]) se han utilizado para inducir extremidades en los flancos de embriones tempranos y nuevos dígitos en la región interdigital, respectivamente 16,17,18,19,20,21 . Estos experimentos evidencian el poder y la utilidad de esta técnica para determinar la etapa de compromiso o competencia de tejidos o grupos de células expuestas a las moléculas.
En este protocolo, la extremidad del pollito en la etapa de formación de dedos sirvió como modelo experimental para presentar paso a paso cómo preparar e implantar las cuentas empapadas. Sin embargo, esta herramienta experimental no se limita a esta aplicación, sino que puede ser explotada en cualquier modelo animal experimental y cualquier punto de tiempo in vitro e in vivo para estudiar la inducción, la diferenciación, la muerte celular y el modelado.
Protocol
Representative Results
Discussion
La principal ventaja de la herramienta experimental detallada en este protocolo es poder controlar el tiempo y la ubicación de la exposición a las perlas empapadas en una molécula experimental determinada. La combinación del posicionamiento correcto con un tiempo de desarrollo preciso proporciona enormes posibilidades para estudiar los procesos de diferenciación celular. La realización de estos experimentos en tejido indiferenciado permite investigar los primeros eventos cruciales en el linaje celular. Por ejemplo,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvención IN211117 e IN213314] y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [número de subvención 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] otorgado a JC-M. JC M-L recibió una beca postdoctoral del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Los autores agradecen la ayuda del Lic. Lucía Brito del Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM en la preparación de referencias de este manuscrito.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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