使用浸泡珠测定分析鸡胚胎发生过程中的细胞分化，形态发生和图案化
Summary
浸泡的磁珠测定涉及在任何发育时间点靶向递送测试试剂，以研究细胞分化和形态发生的调节。提出了适用于任何实验动物模型的详细方案，用于制备三种不同类型的浸泡珠子并将其植入鸡胚的间位中。
Abstract
在胚胎发育过程中，许多遗传程序被激活，这些程序协调细胞分化，以产生惊人的体细胞，组织和器官的多样性。这些遗传程序的精确激活是由形态原调节的，形态原是可扩散分子，在不同的阈值指导细胞命运。要了解基因激活如何协调形态发生，需要研究发育过程中由形态发生触发的局部相互作用。使用浸泡在蛋白质中的珠子或植入胚胎不同区域的药物可以研究特定分子在建立手指和其他发育过程中的作用。该实验技术提供有关细胞诱导，细胞命运和模式形成的控制的信息。因此，这种浸泡的珠子测定是一种非常强大和有价值的实验工具，适用于其他胚胎模型。
Introduction
在胚胎发育过程中控制基因表达的分子机制的突破使我们能够了解细胞命运是如何决定的。一旦细胞开始转录因子1的分子表达，就会对不同的细胞谱系做出承诺。这种表达模式在空间和时间上高度协调，从而指导细胞，组织和器官的塑造，定位和图案化1，2，3，4，5。胚胎诱导是通过建立限制细胞潜力的层次结构来使细胞致力于特定谱系的过程，其中甚至包括像Spemann组织者6，7那样产生基本的身体计划。胚孔背唇在宿主胚胎8，9中诱导第二胚胎轴。今天，借助嫁接和其他经典实验结合分子方法，已知不同的转录因子和生长因子在Spemann组织器10中具有指导胚胎诱导的功能。因此，实验操作是了解胚胎发生过程中细胞分化，形态发生和图案化过程的重要工具。
有趣的是，在组织移植困难的胚胎系统中，或者当诱导剂已经众所周知时，载体用于递送分子（例如，蛋白质，化学物质，毒素等）以调节细胞分化，形态发生甚至图案化。一种这样的载体系统涉及在任何发育时间点将浸泡在特定分子中的珠子植入任何实验模型生物体中，以确定所述试剂的效果或指导所述模型的分化。例如，通过将视黄酸（RA）浸泡的珠子植入鸡翅肢芽中，Cheryl Tickle等人（1985）证明RA诱导声波刺猬在极化活性区（ZPA）11，12中的表达。使用相同的实验策略发现RA控制了在手指发育过程中肢体芽中体细胞和细胞死亡的不对称性，并在其他胚胎肢体区域控制13，14，15。其他因素，主要是蛋白质（例如，成纤维细胞生长因子[FGF]，转化生长因子β[TGF-ß]）已被用于诱导早期胚胎侧腹和新指的肢体，分别为16，17，18，19，20，21.这些实验证明了该技术在确定暴露于分子的组织或细胞组的承诺阶段或能力方面的强大功能和实用性。
在该协议中，在手指形成阶段的雏鸡肢体作为实验模型，逐步展示如何准备和植入浸泡的珠子。然而，该实验工具不限于此应用，而是可以在任何实验动物模型和 任何体外 和体内时间点 中 利用，以研究诱导，分化，细胞死亡和图案化。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议中详述的实验工具的主要优点是能够控制暴露于浸泡在给定实验分子中的磁珠的时间和位置。将正确的定位与精确的发育时间相结合，为研究细胞分化过程提供了巨大的可能性。在未分化的组织中进行这些实验可以研究细胞谱系中的第一个关键事件。例如，将TGFß浸泡的珠子放在胚胎肢体28 HH的指间组织中会导致异位手指的形成，其中触发分子级联，诱导主 Sox925的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了墨西哥国立自治大学（DGAPA）[拨款编号IN211117和IN213314]和授予JC-M的全国科学与技术大会（CONACyT）[授予1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]的支持。JC M-L获得了国家科学与技术委员会（CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887）的博士后奖学金。作者感谢Lic的帮助。来自墨西哥国立自治大学生物医学研究所的Lucia Brito在本手稿的准备参考中。
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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