JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

Urasil-DNA glikozilaz aktivitesini test etmek için etiketlenmemiş, radyo-izotopik olmayan bir yöntem, doğrudan apurinik / apirimidinik alan içeren ürün analizi için MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak geliştirilmiştir. Tahlil, DNA glikozilaz ölçümü için oldukça basit, spesifik, hızlı ve kullanımı kolay olduğunu kanıtladı.

Abstract

Urasil-DNA glikozilaz (UDG), sitozinin hidrolitik deaminasyonundan oluşan urasilin düzeltilmesi için baz eksizyon onarım yolunda önemli bir bileşendir. Bu nedenle, genom bütünlüğünün korunması için çok önemlidir. UDG aktivitesini ölçmek için oldukça spesifik, etiketsiz, radyo-izotopik olmayan bir yöntem geliştirilmiştir. Bölgeye özgü bir urasil içeren sentetik bir DNA dubleks, UDG tarafından bölündü ve daha sonra Matris destekli Lazer Desorpsiyon / İyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) analizine tabi tutuldu. DNA’daki apurinik / apirimidinik bölge (AP) ürününü iplik kopmadan korumak için bir protokol oluşturuldu. Substrattan ürüne m/z değerindeki değişim, urasil hidrolizini UDG ile değerlendirmek için kullanıldı. UDG kinetik analizi için Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM / s ve Kcat = 9.31 s-1 veren bir G: U substratı kullanıldı. Bu yöntemin urasil glikozilaz inhibitörü (UGI) testine uygulanması, 7.6 pM’lik bir IC50 değeri vermiştir. Tek sarmallı ve çift sarmallı DNA substratları içinde çeşitli pozisyonlarda urasil kullanan UDG özgüllüğü, farklı bölünme verimlilikleri göstermiştir. Bu nedenle, bu basit, hızlı ve çok yönlü MALDI-TOF MS yöntemi, çeşitli monofonksiyonel DNA glikozilazları için mükemmel bir referans yöntemi olabilir. Aynı zamanda DNA glikozilaz inhibitörü taraması için bir araç olarak potansiyele sahiptir.

Introduction

Urasil RNA’da normal bir baz olmasına rağmen, genomik DNA’da sık görülen ve oldukça mutajenik bir lezyondur. Urasil, bir deoksisitidinin spontan/enzimatik hidrolitik deaminasyonundan kaynaklanabilir. Her canlı hücrede, bu deaminasyon fizyolojik koşullar altında günde 100-500 kez gerçekleşir1,2. Bu değişiklikler onarılmazsa, DNA dizisi bileşiminde mutasyona neden olan bir değişiklik olabilir. DNA’daki urasil, replikasyon sırasında dATP ile eşleşmeyi tercih ettiğinden, sitozin urasil’e deaminasyon yaparsa, iki replikasyon olayında, döl DNA3’ün yarısında yeni bir G: C’den A: T’ye geçiş mutasyonu olacaktır.

Genetik stabiliteyi korumak için hücresel stratejiler arasında, baz eksizyon onarımı (BER), DNA4’teki urasil gibi hasarlı bazları onaran önemli bir mekanizmadır. BER, evrimsel olarak oldukça korunmuş bir süreçtir. İki genel BER yolu vardır: tek bir nükleotidin onarım yoluna giden kısa yama yolu ve en az iki nükleotidin onarım yolunu üreten uzun yama yolu5. BER, birkaç adımda gerçekleşen koordineli bir mekanizmadır. BER’deki ilk adım, hasarlı nükleotid bazının hasara özgü bir DNA glikozilaz tarafından enzimatik hidrolizidir ve bir apurinik / apirimididinik (AP) ara bölge oluşturur6. Bunu, AP bölgesindeki şeker-fosfat omurgasının bir endonükleaz tarafından bölünmesi, DNA uçlarının bir liyaz ile temizlenmesi, bir DNA polimeraz ile boşluk doldurulması ve son nickin bir ligaz ile kapatılması izler5.

Urasil-DNA glikozilaz (UDG), urasili Escherichia coli’deki BER için urasil içeren DNA’dan hidrolize eder. Farklı ayırma tekniklerini içeren radyo-etiketli DNA kullanan geleneksel UDG testleri6,7,8,9,10,11,12,13 genellikle zaman alıcı, emek yoğun, maliyetli etiketleme reaktifleri, karmaşık prosedürler ve radyoaktif maddelere maruz kalma risklerini azaltmak için yoğun eğitim ve uygulama gerektirir. Florometrik oligonükleotid testleri, moleküler işaretçilere ve Förster rezonans enerji transfer teknolojisine15,16,17,18,19,20 ek olarak radyoizotop etiketlemesinin14 yerine geliştirilmiştir. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen tüm yöntemler için özel etiketleme gereklidir. Son zamanlarda etiketsiz biyosensör tahlilleri21,22,23 ve G-dörtlüx24,25,26 oluşumuna dayanan kolorimetrik yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, problardaki çoklu A: U çiftleri veya özel olarak tasarlanmış diziler, enzim birimi tanımını zorlaştırır.

MALDI-TOF MS, DNA ANALIZINDE ÇOK FAYDALı OLABILECEK BIR TEKNOLOJIDIR. Geliştirilen uygulamalar arasında tek nükleotid polimorfizmi genotipleme27,28, modifiye nükleotid analizi29 ve DNA onarımı ara tanımlama30,31,32,33,34 bulunmaktadır. MALDI-TOF MS, AP bölgesi içeren DNA ürünlerini tespit etmek için DNA glikozilaz analizi için kolayca benimsenmelidir. Bununla birlikte, DNA’daki AP bölgeleri birçok deneysel koşulda iplikçik kopmasına eğilimlidir33. Burada, önemli bir iplik kopma gürültüsü olmadan AP saha üretimini doğrudan ölçmek için MALDI-TOF MS kullanılarak bir UDG testi sunulmaktadır. Bu etiketsiz yöntemle çalışmak kolaydır ve DNA glikozilaz inhibitörü taramasının farmasötik uygulaması için yüksek bir potansiyele sahiptir.

Protocol

1. Substrat/şablon hazırlama Dubleks bölge için ~50 ± dengeli G + C içeriğine ve minimum 50 °C erime sıcaklığına sahip urasil substrat/şablon dubleks tasarlayın.NOT: 18 nt substratlar ve 19 nt şablonları arasındaki bir nükleotid farkı (Tablo 1 ve Şekil 1) daha iyi MS sinyali yorumlamasına ve uygun tavlamaya yardımcı olur. Şablon iplikçik, A-U veya G-U uyumsuzlukları üretmek için tamamlayıcı DNA görevi görür …

Representative Results

Şablonlar ve alt tabakalarÖrnek olarak bir G şablonu ile eşleştirilmiş merkezde U ile sentetik oligonükleotidler (U + 9) alındığında (Şekil 1A), sentetik oligonükleotid saflığının kalite kontrolü için eşdeğer miktarda şablon ve urasil içeren substratın boş bir kontrolü kullanılabilir (Şekil 1B; sinyaller belirlenen m / z ve düşük arka plan gürültüsü ile eşleşir). MS veri analizi için tepe yükseklikleri …

Discussion

Bu yazıda, AP içeren DNA ürünlerini doğrudan tespit etmek için UDG MALDI-TOF MS tahlil yönteminin kullanılması için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu yöntemin temel avantajları, urasil içeren substratların etiketsiz, ölçeklenebilir, kullanımı kolay olması ve substrat tasarımında daha fazla esneklik sağlamasıdır.

UDG tedarikçisi tarafından önerilen fenol / kloroform ekstraksiyonu, ürün DNA’sının bozulmasını önlemek için enzimin inaktivasyonunu sağ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NCFPB Fonksiyonel Genomik Entegre Çekirdek Tesisi’ne (Taipei, Tayvan) ve NRPB Farmakogenomik Laboratuvarı’na (Taipei, Tayvan) teknik destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Tayvan, R.O..C. Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenmiştir [hibe numarası MOST109-2314-B-002 -186 – K.-Y.S., ÇOĞU 107-2320-B-002-016-MY3 – S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 – W.-h.F.]. H.-L.C., Ulusal Tayvan Üniversitesi’nden doktora bursu almıştır. Açık erişim ücreti için finansman: Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. 생화학. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. 생화학. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O’Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. 생화학. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Uracil-DNA GlycosylaseMALDI-TOF Mass SpectrometryDNA RepairAP ProductLabel-freeEnzyme Activity AssayGuanine-uracil BaseReaction BufferSubstrate PreparationReaction Termination

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image