Dosage de la glycosylase uracile-ADN par désorption laser assistée par matrice / ionisation Analyse par spectrométrie de masse au temps de vol

Bien que l’uracile soit une base normale dans l’ARN, il s’agit d’une lésion commune et hautement mutagène dans l’ADN génomique. L’uracile peut résulter d’une désamination hydrolytique spontanée/enzymatique d’une désoxycytidine. Dans chaque cellule vivante, cette désamination se produit 100 à 500 fois par jour dans des conditions ^{physiologiques1,2}. Si ces altérations ne sont pas réparées, il peut y avoir un changement dans la composition de la séquence d’ADN, provoquant une mutation. Comme l’uracile dans l’ADN préfère s’apparier avec le dATP pendant la réplication, si la cytosine se désamine en uracile, dans deux événements de réplication, il y aura une nouvelle mutation de transition G:C à A:T dans la moitié de l’ADN de la ^descendance3.

Parmi les stratégies cellulaires pour maintenir la stabilité génétique, la réparation de l’excision de base (BER) est un mécanisme essentiel qui répare les bases endommagées, telles que l’uracile, dans ^l’ADN4. Le BER est un processus hautement conservé sur le plan de l’évolution. Il existe deux voies BER générales : la voie à patch court menant à un tractus de réparation d’un seul nucléotide et la voie à long patch qui produit un tractus de réparation d’au moins deux nucléotides5. Le BER est un mécanisme coordonné qui se déroule en plusieurs étapes. La première étape du BER est l’hydrolyse enzymatique de la base nucléotidique endommagée par une glycosylase d’ADN spécifique aux dommages pour générer un site intermédiaire purinique/apyrimidinique (AP)⁶. Ceci est suivi par le clivage de l’épine dorsale sucre-phosphate sur le site AP par une endonucléase, le nettoyage des extrémités de l’ADN par une lyase, le remplissage de l’espace par une ADN polymérase et le scellement de l’entaille finale par une ligase5.

L’uracile-ADN glycosylase (UDG) hydrolyse l’uracile à partir de l’ADN contenant de l’uracile pour le BER chez Escherichia coli. Les tests UDG conventionnels utilisant de l’ADN radiomarqué impliquant différentes techniques ^de séparation6,7,8,9,10,11,12,13 prennent généralement beaucoup de temps, demandent beaucoup de main-d’œuvre, avec des réactifs d’étiquetage coûteux, des procédures compliquées et nécessitent une formation et une pratique intensives pour réduire les risques d’exposition aux matières radioactives. Des dosages fluorométriques d’oligonucléotides ont été développés en remplacement du marquage des ^{radio-isotopes14}, en plus des balises moléculaires et de la technologie de transfert d’énergie par résonance de Förster15,16,17,18,19,20. Cependant, un étiquetage spécifique est requis pour toutes les méthodes susmentionnées. Récemment, des tests de biocapteurs sans ^{étiquette21,22,23} et des méthodes colorimétriques basées sur la formation d’un G-quadruplex24,25,26 ont été ^développés. Cependant, plusieurs paires A:U ou séquences spécialement conçues dans les sondes compliquent la définition de l’unité enzymatique.

MALDI-TOF MS est une technologie qui pourrait être d’une grande utilité dans l’analyse de l’ADN. Les applications développées comprennent le génotypage du polymorphisme mononucléotidique27,28, l’analyse de nucléotides ^modifiés29 et l’identification intermédiaire de réparation de l’ADN30,31,32,33,34. Maldi-TOF MS devrait être facilement adopté pour l’analyse de l’ADN glycosylase afin de détecter les produits d’ADN contenant du site AP. Cependant, les sites AP dans l’ADN sont sujets à la rupture des brins dans de nombreuses conditions ^{expérimentales33}. Un test UDG est présenté ici en utilisant MALDI-TOF MS pour mesurer directement la production du site AP sans bruit de rupture de brin significatif. Cette méthode sans étiquette est facile à utiliser et présente un potentiel élevé pour l’application pharmaceutique du dépistage des inhibiteurs de l’ADN glycosylase.