فحص الجليكوزيلاز Uracil-DNA بواسطة تحليل الطيف الكتلي للامتصاص / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة
Summary
تم تطوير طريقة غير موسومة وغير نظيرية مشعة لفحص نشاط اليوراسيل – الحمض النووي للجليكوسيلاز باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF لتحليل المنتج المباشر المحتوي على موقع apurinic / apyrimidinic. أثبت الفحص أنه بسيط للغاية ومحدد وسريع وسهل الاستخدام لقياس جليكوزيلاز الحمض النووي.
Abstract
يعد اليوراسيل – الحمض النووي غليكوزيلاز (UDG) مكونا رئيسيا في مسار إصلاح استئصال القاعدة لتصحيح اليوراسيل المتكون من إزالة الأمين المائي للسيتوزين. وبالتالي ، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على سلامة الجينوم. ووضعت طريقة محددة للغاية وغير موسومة وغير نظائر مشعة لقياس نشاط ال UDG. تم شق دوبلكس الحمض النووي الاصطناعي الذي يحتوي على يوراسيل خاص بالموقع بواسطة UDG ثم تم إخضاعه لتحليل الطيف الكتلي للامتصاص بالليزر / التأين بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF MS). تم إنشاء بروتوكول للحفاظ على منتج موقع apurinic / apyrimidinic (AP) في الحمض النووي دون كسر حبل. تم استخدام التغيير في قيمة m / z من الركيزة إلى المنتج لتقييم التحلل المائي لليوراسيل بواسطة UDG. تم استخدام الركيزة G:U للتحليل الحركي UDG مما أسفر عن Km = 50 nM ، Vmax = 0.98 nM / s ، و Kcat = 9.31 s-1. أدى تطبيق هذه الطريقة على اختبار مثبط جليكوزيلاز اليوراسيل (UGI) إلى قيمة IC50 تبلغ 7.6 جزء في المليون. أظهرت خصوصية UDG باستخدام uracil في مواقع مختلفة داخل ركائز الحمض النووي المفردة والمزدوجة التي تقطعت بها السبل كفاءات انقسام مختلفة. وبالتالي ، يمكن أن تكون طريقة MALDI-TOF MS البسيطة والسريعة ومتعددة الاستخدامات طريقة مرجعية ممتازة لمختلف جليكوزيلاز الحمض النووي أحادي الوظيفة. كما أن لديها القدرة كأداة لفحص مثبطات الحمض النووي للجليكوزيلاز.
Introduction
على الرغم من أن اليوراسيل هو قاعدة طبيعية في الحمض النووي الريبي ، إلا أنه آفة شائعة ومطفرة للغاية في الحمض النووي الجينومي. يمكن أن ينشأ Uracil من إزالة الأمين المائي التلقائي / الأنزيمي من deoxycytidine. في كل خلية حية ، يحدث هذا التطهير 100-500 مرة في اليوم في ظل الظروف الفسيولوجية1,2. إذا لم يتم إصلاح هذه التعديلات ، فقد يكون هناك تغيير في تكوين تسلسل الحمض النووي ، مما يسبب طفرة. نظرا لأن اليوراسيل في الحمض النووي يفضل الاقتران مع dATP أثناء التكرار ، إذا كان السيتوزين يزيل الأمينات إلى اليوراسيل ، في حدثين للتكرار ، ستكون هناك طفرة انتقالية جديدة من G:C إلى A:T في نصف الحمض النووي للذرية 3.
من بين الاستراتيجيات الخلوية للحفاظ على الاستقرار الوراثي ، يعد إصلاح استئصال القاعدة (BER) آلية أساسية لإصلاح القواعد التالفة ، مثل اليوراسيل ، في DNA4. BER هي عملية محفوظة تطوريا للغاية. هناك مساران عامان ل BER: مسار التصحيح القصير المؤدي إلى مسار إصلاح لنيوكليوتيد واحد ومسار التصحيح الطويل الذي ينتج مسارا لإصلاح اثنين على الأقل من النيوكليوتيدات 5. BER هي آلية منسقة تحدث في عدة خطوات. الخطوة الأولى في BER هي التحلل المائي الأنزيمي لقاعدة النيوكليوتيدات التالفة بواسطة جليكوزيلاز الحمض النووي الخاص بالتلف لتوليد موقع وسيط أبورينيك / أبيريميدينيك (AP) 6. ويتبع ذلك انقسام العمود الفقري للسكر والفوسفات في موقع AP بواسطة endonuclease ، وينتهي تنظيف الحمض النووي بواسطة لياز ، وملء الفجوة بواسطة بوليميراز الحمض النووي ، وختم النيك النهائي بواسطة ligase5.
يقوم اليوراسيل-الحمض النووي غليكوزيلاز (UDG) بتحلل اليوراسيل من الحمض النووي المحتوي على اليوراسيل ل BER في الإشريكية القولونية. عادة ما تكون فحوصات UDG التقليدية باستخدام الحمض النووي الموسوم إشعاعيا والتي تنطوي على تقنيات فصل مختلفة6،7،8،9،10،11،12،13 تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة ، مع كواشف وضع العلامات المكلفة ، والإجراءات المعقدة ، وتتطلب تدريبا وممارسة مكثفين للحد من مخاطر التعرض للمواد المشعة. تم تطوير مقايسات أوليغونوكليوتيد الفلورومترية كبديل لوضع العلامات على النظائر المشعة14، بالإضافة إلى المنارات الجزيئية وتكنولوجيا نقل طاقة الرنين Förster15,16,17,18,19,20. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى وضع علامات محددة لجميع الطرق المذكورة أعلاه. تم مؤخرا تطوير اختبارات أجهزة الاستشعار الحيوية الخالية من الملصقات 21،22،23 وطرق قياس الألوان القائمة على تشكيل G-quadruplex24،25،26. ومع ذلك ، فإن أزواج A: U المتعددة أو التسلسلات المصممة خصيصا في المجسات تعقد تعريف وحدة الإنزيم.
MALDI-TOF MS هي تقنية يمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة في تحليل الحمض النووي. وتشمل التطبيقات التي تم تطويرها التنميط الجيني متعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات27،28، وتحليل النيوكليوتيدات المعدلة29، وتحديد وسيط إصلاح الحمض النووي30،31،32،33،34. يجب اعتماد MALDI-TOF MS بسهولة لتحليل جليكوزيلاز الحمض النووي للكشف عن منتجات الحمض النووي التي تحتوي على موقع AP. ومع ذلك ، فإن مواقع AP في الحمض النووي عرضة لكسر الخيوط في ظل العديد من الظروف التجريبية 33. يتم عرض فحص UDG هنا باستخدام MALDI-TOF MS لقياس إنتاج موقع AP مباشرة دون ضوضاء كبيرة في كسر الحبل السري. هذه الطريقة الخالية من الملصقات سهلة الاستخدام ولديها إمكانات عالية للتطبيق الصيدلاني لفحص مثبطات الحمض النووي للجليكوزيلاز.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه الورقة إجراء مفصلا لاستخدام طريقة فحص UDG MALDI-TOF MS للكشف مباشرة عن منتجات الحمض النووي المحتوية على AP. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الركائز التي تحتوي على اليوراسيل خالية من الملصقات ، وقابلة للتطوير ، وسهلة العمل معها ، وتوفر مرونة أكبر في تصميم الركيزة.
يتيح ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المرفق الأساسي المتكامل لعلم الجينوم الوظيفي التابع للمجلس الوطني لعلم الجينوم الوظيفي (تايبيه، تايوان) ومختبر الجينوم الدوائي NRPB (تايبيه، تايوان) على دعمهما التقني. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا ، تايوان ، R.O.C. [رقم المنحة MOST109-2314-B-002 -186 إلى K.-Y.S. ، ومعظمها 107-2320-B-002-016-MY3 إلى S.-Y.C. ، ومعظمها 110-2320-B-002-043 إلى W.-h.F.]. H.-L.C. حاصل على زمالة الدكتوراه من جامعة تايوان الوطنية. تمويل رسوم الوصول المفتوح: وزارة العلوم والتكنولوجيا، R.O.C.
Materials
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
| Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
| Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
| Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
| Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
| Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
| Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
| UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
| Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
| UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
| Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
References
- Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. 생화학. 29 (10), 2532-2537 (1990).
- Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
- Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
- Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
- Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
- Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
- Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
- Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
- Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
- Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
- Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
- Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. 생화학. 34 (18), 6109-6119 (1995).
- Xia, L., O’Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
- Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
- Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
- Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
- Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
- Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
- Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
- Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
- Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
- McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
- Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
- Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
- Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
- Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
- Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
- Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
- Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
- Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
- Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
- Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
- Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
- Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
- Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
- Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
- Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
- Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. 생화학. 30 (16), 4055-4061 (1991).
- Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
- Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
- Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
- Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
- Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).
