L'estrazione di molecole di glicogeno epatico per la determinazione della struttura del glicogeno

Il glicogeno è un polimero complesso e iperramificato del glucosio che si trova negli animali, nei funghi e nei batteri¹. Nei mammiferi, il glicogeno epatico funziona come un tampone glicemico, preservando l’omeostasi, mentre il glicogeno muscolare agisce come un serbatoio di glucosio a breve termine per fornire energia direttamente². La struttura del glicogeno è spesso descritta da tre livelli (mostrati nella Figura 1): 1. Le catene lineari sono formate da monomeri di glucosio tramite legami glicosidici (1→4)-α, con punti di diramazione collegati tramite legami glicosidici (1→6)-α; 2. particelle β altamente ramificate (~20 nm di diametro) che, soprattutto in tessuti come il muscolo scheletrico, agiscono come molecole indipendenti di glicogeno ^3,4; 3. particelle di glicogeno α più grandi (fino a 300 nm di diametro) costituite da unità di glicogeno β più piccole, che si trovano nel fegato⁵, nel cuore⁶ e in alcune specie non mammiferi⁷. Le particelle di α epatica dei topi diabetici sono molecolarmente fragili, con una propensione a degradarsi in particelle β quando vengono disciolte in dimetilsolfossido (DMSO), mentre α particelle dei controlli non diabetici rimangono generalmente invariate. Un’ipotesi è che questa fragilità possa esacerbare lo scarso equilibrio glicemico osservato nel diabete, con le fragili particelle α che potrebbero comportare percentuali più elevate della particella^β 8,9,10,11 degradata più rapidamente.

I metodi tradizionali di estrazione del glicogeno utilizzano le condizioni relativamente difficili di esposizione del tessuto epatico a una soluzione alcalina calda¹² o a soluzioni acide come l’acido tricloroacetico (TCA)¹³ o l’acido perclorico (PCA)¹⁴. Sebbene siano efficaci nel separare il glicogeno da altri componenti del tessuto epatico, questi metodi degradano inevitabilmente la struttura del glicogeno in una certa misura^15,16. Sebbene questi metodi siano adatti per la misurazione quantitativa del contenuto di glicogeno, non sono ideali per gli studi incentrati sull’ottenimento di informazioni strutturali sul glicogeno a causa di questo danno strutturale. Dallo sviluppo di questi metodi, è stata sviluppata una procedura di estrazione più blanda che utilizza il tampone Tris a freddo (che ha dimostrato di inibire la degradazione della glucosidasi) con ultracentrifugazione a gradiente di densità^del saccarosio 17,18,19. Con il pH controllato a ~8, questo metodo non sottopone il glicogeno all’idrolisi acida o alcalina osservata nelle procedure precedenti.

L’ultracentrifugazione a gradiente di densità del saccarosio del tessuto epatico omogeneizzato può separare le particelle di glicogeno dalla maggior parte del materiale cellulare. Se necessario, un’ulteriore purificazione può essere eseguita mediante cromatografia preparativa ad esclusione dimensionale, con conseguente raccolta di glicogeno purificato con proteine associate al glicogeno²⁰. Sebbene questo metodo, in condizioni più miti, abbia maggiori probabilità di preservare la struttura del glicogeno, è difficile evitare che una parte del glicogeno venga persa nel surnatante, in particolare le particelle di glicogeno più piccole che sono meno dense¹⁵. Un’altra potenziale causa di perdita di glicogeno è che le condizioni più miti consentono una certa degradazione enzimatica, con conseguente minore resa di glicogeno rispetto ai metodi di estrazione più difficili. Recenti ricerche hanno riportato l’ottimizzazione del metodo di estrazione del glicogeno epatico per preservare la struttura del glicogeno²¹. Qui, sono state testate varie concentrazioni di saccarosio (30%, 50%, 72,5%) per determinare se concentrazioni di saccarosio più basse riducessero al minimo la perdita di particelle di glicogeno più piccole. La logica era che la densità inferiore avrebbe permesso alle particelle più piccole e meno dense di penetrare nello strato di saccarosio e aggregarsi nel pellet con il resto del glicogeno.

In questo studio, i metodi di estrazione con e senza una fase di ebollizione di 10 minuti sono stati confrontati per verificare se gli enzimi di degradazione del glicogeno potessero essere denaturati, con conseguente estrazione di più glicogeno che era anche esente da degradazione parziale. Per determinare la struttura del glicogeno estratto sono state utilizzate le distribuzioni delle dimensioni molecolari intere e le distribuzioni della lunghezza della catena di glicogeno, in modo simile a un’ottimizzazione dell’estrazione dell’amido pubblicata in precedenza²². La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) con rilevazione dell’indice di rifrazione differenziale (DRI) è stata utilizzata per ottenere le distribuzioni dimensionali del glicogeno, che descrivono il peso molecolare totale in funzione delle dimensioni molecolari. L’elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE) è stata utilizzata per analizzare le distribuzioni della lunghezza della catena, che descrivono il numero relativo di catene glucosidiche di ciascuna dimensione (o grado di polimerizzazione). Questo documento descrive la metodologia di estrazione del glicogeno dai tessuti epatici sulla base del precedente studio di ottimizzazione²¹. I dati suggeriscono che il metodo più adatto per preservare la struttura del glicogeno è una concentrazione di saccarosio del 30% con una fase di ebollizione di 10 minuti.