De extractie van leverglycogeenmoleculen voor de bepaling van de glycogeenstructuur

Glycogeen is een complex, hypervertakt polymeer van glucose dat voorkomt in dieren, schimmels en^bacteriën1. Bij zoogdieren functioneert leverglycogeen als een bloedglucosebuffer, waardoor de homeostase behouden blijft, terwijl spierglycogeen fungeert als een kortetermijnglucosereservoir om direct energie te leveren². De structuur van glycogeen wordt vaak beschreven door drie niveaus (weergegeven in figuur 1): 1. Lineaire ketens worden gevormd door glucosemonomeren via (1→4)-α glycosidische bindingen, waarbij vertakkingspunten zijn verbonden via (1→6)-α glycosidische bindingen; 2. sterk vertakte β deeltjes (~20 nm in diameter) die, vooral in weefsels zoals skeletspieren, fungeren als onafhankelijke glycogeenmoleculen ^3,4; 3. grotere α glycogeendeeltjes (tot 300 nm in diameter) die bestaan uit kleinere β glycogeeneenheden, die worden aangetroffen in de lever⁵, hart⁶ en in sommige niet-zoogdiersoorten⁷. Lever- α deeltjes van diabetische muizen zijn moleculair kwetsbaar, met de neiging om af te breken tot β-deeltjes wanneer ze worden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO), terwijl α deeltjes van niet-diabetische controles over het algemeen onveranderd blijven. Een hypothese is dat deze kwetsbaarheid de slechte bloedglucosebalans bij diabetes kan verergeren, waarbij de fragiele α deeltjes mogelijk resulteren in hogere proporties van het sneller afgebroken β deeltje 8,9,10,11.

Traditionele glycogeenextractiemethoden maken gebruik van de relatief zware omstandigheden waarbij het leverweefsel wordt blootgesteld aan hete alkalische oplossing¹² of zure oplossingen zoals trichloorazijnzuur (TCA)¹³ of perchloorzuur (PCA)¹⁴. Hoewel deze methoden effectief zijn in het scheiden van het glycogeen van andere componenten van het leverweefsel, degraderen ze onvermijdelijk de glycogeenstructuur tot op zekere hoogte^15,16. Hoewel deze methoden geschikt zijn voor het kwantitatief meten van het glycogeengehalte, zijn ze vanwege deze structurele schade niet ideaal voor studies die gericht zijn op het verkrijgen van structurele informatie over het glycogeen. Sinds de ontwikkeling van deze methoden is een mildere extractieprocedure ontwikkeld die gebruik maakt van koude Tris-buffer (waarvan is aangetoond dat het de afbraak van glucosidase remt) met ultracentrifugatie met sucrosedichtheidsgradiënt 17,18,19. Met een pH-waarde van ~8 wordt het glycogeen bij deze methode niet onderworpen aan de zure of alkalische hydrolyse die in eerdere procedures werd gezien.

Sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie van gehomogeniseerd leverweefsel kan glycogeendeeltjes scheiden van het grootste deel van het celmateriaal. Indien nodig kan aanvullende zuivering worden uitgevoerd door middel van preparatieve grootte-uitsluitingschromatografie, wat resulteert in het verzamelen van gezuiverd glycogeen met aangehechte glycogeen-associërende eiwitten²⁰. Hoewel deze methode, met mildere omstandigheden, meer kans heeft om de structuur van glycogeen te behouden, is het moeilijk om te voorkomen dat een deel van het glycogeen verloren gaat in het supernatant, vooral kleinere glycogeendeeltjes die minder dicht^zijn15. Een andere mogelijke oorzaak van glycogeenverlies is dat de mildere omstandigheden enige enzymatische afbraak mogelijk maken, wat resulteert in lagere glycogeenopbrengsten in vergelijking met zwaardere extractiemethoden. Recent onderzoek meldde optimalisatie van de lever-glycogeenextractiemethode om de structuur van glycogeen te behouden²¹. Hier werden verschillende sucroseconcentraties (30%, 50%, 72,5%) getest om te bepalen of lagere sucroseconcentraties het verlies van kleinere glycogeendeeltjes minimaliseerden. De grondgedachte was dat de lagere dichtheid het mogelijk zou maken dat kleinere, minder dichte deeltjes de sucroselaag zouden binnendringen en zich in de pellet zouden verzamelen met de rest van het glycogeen.

In deze studie werden de extractiemethoden met en zonder een kookstap van 10 minuten vergeleken om te testen of glycogeenafbraakenzymen konden worden gedenatureerd, wat resulteerde in de extractie van meer glycogeen dat ook vrij was van gedeeltelijke afbraak. Verdelingen van de hele moleculaire grootte en de lengteverdelingen van de glycogeenketen werden gebruikt om de structuur van het geëxtraheerde glycogeen te bepalen, vergelijkbaar met een eerder gepubliceerde optimalisatie van zetmeelextractie²². Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met differentiële brekingsindex (DRI)-detectie werd gebruikt om de grootteverdelingen van glycogeen te verkrijgen, die het totale molecuulgewicht beschrijven als functie van de molecuulgrootte. Fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) werd gebruikt om de ketenlengteverdelingen te analyseren, die het relatieve aantal glucosideketens van elke gegeven grootte (of mate van polymerisatie) beschrijven. Dit artikel beschrijft de methodologie voor het extraheren van glycogeen uit leverweefsels op basis van de vorige optimalisatiestudie²¹. De gegevens suggereren dat de methode die het meest geschikt is om de glycogeenstructuur te behouden, een sucroseconcentratie van 30% is met een kookstap van 10 minuten.