ניטור בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים בציטוקינים
Summary
הסתגלות מטבולית היא בסיסית עבור תאי T כפי שהיא מכתיבה בידול, התמדה, וציטוטוקסיות. כאן, פרוטוקול ממוטב לניטור נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים ex vivo .
Abstract
במהלך ההפעלה, חילוף החומרים של תאי T מסתגל לשינויים המשפיעים על גורלם. עלייה בזרחן חמצוני מיטוכונדריאלי היא הכרחית להפעלת תאי T, והישרדותם של תאי T זיכרון T תלויה בשיפוץ מיטוכונדריאלי. כתוצאה מכך, זה משפיע על התוצאה הקלינית ארוכת הטווח של אימונותרפיות סרטן. שינויים באיכות תאי T נחקרים לעתים קרובות על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות סמני שטח ידועים ולא ישירות על ידי מצבם המטבולי. זהו פרוטוקול ממוטב למדידת נשימה מיטוכונדריאלית בזמן אמת של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי והציטוקינים IL-2 ו- IL-15, המשפיעים באופן שונה על חילוף החומרים של תאי T. הוכח כי המצב המטבולי של תאי T ניתן להבחין בבירור על ידי מדידת צריכת החמצן בעת עיכוב מתחמי מפתח במסלול המטבולי וכי הדיוק של מדידות אלה תלוי מאוד בריכוז מעכב אופטימלי ואסטרטגיית הזרקת מעכבים. פרוטוקול מתוקנן זה יסייע ליישם נשימה מיטוכונדריאלית כסטנדרט לכושר תאי T בניטור ולמידה של חיסונים לסרטן.
Introduction
התפתחות ותפקוד תקינים של תאי T חיוניים ליכולתה של מערכת החיסון לזהות ולהגיב לאנטיגנים. זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי (OxPhos) משתנה בהתאם למצב תא ה- T. תאי T נאיביים משתמשים בעיקר באוקספוס כדי לייצר ATP, בעוד שתאי T מופעלים עוברים מעבר מטבולי שבו הגליקוליזה הופכת דומיננטית1. לאחר שלב המשפיע, תת-קבוצה קטנה שנותרה של תאי T זיכרון חוזרת למצב מטבולי הנשלט על ידי OxPhos2,3. השינויים של OxPhos בצע את ההבחנה של תאי T עד כדי כך שאפילו תת קבוצות של תאי T ניתן להבדיל על ידי הספציפי שלהם הוא תכונות OxPhos1. לעומת זאת, OxPhos חשוב לתפקוד תאי T, ועיכוב של OxPhos הוכח לחסום התפשטות וייצור ציטוקינים של תאי T4. לכן, היכולת לכמת את המאפיינים של תא T OxPhos באופן מדויק וניתן לשחזור היא כלי רב עוצמה עבור כל מי שעובד עם תאי T.
בפרוטוקול זה, מאפיינים של תא T OxPhos נמדדים באמצעות מנתח שטף חוץ תאי. תפקיד הליבה של מנתח זה הוא למדוד ברציפות את תכולת החמצן של מדיית הצמיחה של התאים שיש לנתח. חמצן שהוסר ממדיית הצמיחה הוא הניח להיות נלקח על ידי התאים. על ידי טיפול בתאים עם מגוון של מעכבי OxPhos או מכפילים, ירידה בספיגת חמצן קשורה לתפקוד המעכב או המווסת. לדוגמה, עיכוב של סינתאז ATP יוביל לספיגה תאית מופחתת של חמצן שאחרת היה משמש לייצור ATP על ידי זרחן חמצוני. ציוד אחר, כולל האלקטרודה קלארק ומכשיר Oroboros, מציע פונקציונליות דומה, ולכל מכשיר יש יתרונות וחסרונות שונים. מגוון רחב של סוגי תאים יכול לשמש למחקרים במכשירים אלה, אך סוג תא אחד מאתגר במיוחד הוא לימפוציטים T ראשוני אנושיים5. בשל גודלם הקטן, ex vivo הישרדות ירודה, ומאפיינים שאינם חסידים, תאי T ראשוניים אנושיים יכולים להיות מאתגרים ללמוד.
זהו פרוטוקול לחקר הנשימה המיטוכונדריאלית של תאי T ראשוניים אנושיים על ידי מנתח חוץ-תאי. הפרוטוקול מחולק לרוץ אופטימיזציה, שבו ריכוזים אופטימליים של מספר תא לכל באר, כמו גם את הריכוז האופטימלי של oligomycin ו FCCP, נקבעים. יתר על כן, ריצה Assay, שבו התנאים הממוטבים משמשים.
באמצעות PBMCs אנושיים שמקורם בדם ותרביות תאי T ראשיות ex vivo , פרוטוקול זה מדגים את החשיבות של ריכוז מעכב אופטימלי ואת הרלוונטיות של שימוש נפרד במקום הזרקה רציפה של מעכבי מיטוכונדריה בעת עבודה עם סוגי תאים רגישים. לבסוף, הוא הוכיח כי בדיקה זו יכולה לזהות היטב הבדלים עדינים בנשימה מיטוכונדריאלית על קיטוב עם ציטוקינים IL-2 ו IL-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
כימות מפורט ונכון של זרחן חמצוני הוא כלי הכרחי כאשר מתארים את מצבי האנרגיה של תאי T. מצב הכושר המיטוכונדריאלי יכול להיות קשור ישירות לפוטנציאל הפעלת תאי T, הישרדות ובידול1,5. עם פרוטוקול זה, ניתן לקבוע את המאפיינים השונים של זרחן חמצוני (ראה טבלה 4 להס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קספר מולגארד ואן רהבך קיבלו מענקים מטומרמסטר יורגן הולם og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. קספר מולגארדלסו קיבל מענק מבורנקנסורפונדן.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
