Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması
Summary
Plaqueing, bir popülasyondaki canlı virüsleri ölçmek için kullanılan rutin bir yöntemdir. Plaqueing, bakteri ve bakteriyofajlarla çeşitli mikrobiyoloji müfredatlarında sıklıkla öğretilmesine rağmen, memeli virüslerinin veba edilmesi daha karmaşık ve zaman alıcıdır. Bu protokol, herpes simpleks virüsleri ile düzenli çalışma için güvenilir bir şekilde çalışan prosedürleri açıklar.
Abstract
Metodoloji için birincil literatürdeki referanslar da dahil olmak üzere, virüsleri rahatsız etmek için çok sayıda yayınlanmış protokol vardır. Bununla birlikte, virüsleri rahatsız etmek zor olabilir, bu da spesifikasyonlarına ve iyileştirilmesine odaklanmayı gerektirir. Yeni öğrencilerin ustalaşması için inanılmaz derecede zor bir yöntemdir, çünkü esas olarak en küçük ayrıntılara titizlikle dikkat edilmesini gerektirir. Herpes simpleks virüslerini rahatsız etmenin bu gösterimi, yıllar boyunca yöntemi, özellikle nüanslarını görselleştirmekle mücadele edenlere yardımcı olmalıdır. Bu makale, standart plaquing metodolojisinin aynı ilkelerine dayanmakla birlikte, (1) işlem sırasında bozulmayı önlemek için konakçı hücrelerin en iyi nasıl ele alınacağı, (2) viryonların difüzyonunu sınırlamak için agarozdan daha kullanışlı bir viskoz ortam ve (3) güvenilir bir şekilde tekrarlanabilir sonuçlar üreten basit bir fiksasyon ve boyama prosedürünün ayrıntılı bir tanımını içermesi bakımından farklıdır. Ayrıca, eşlik eden video, başkalarına plak tahlilleri yapma talimatı verirken sıklıkla gözden kaçırılan süreçteki daha ince ayrımları göstermeye yardımcı olur.
Introduction
Virüs plak tahlillerinin başlangıcı, 1890’larda virüslerin ilk keşiflerine kadar uzanır1. Tütün mozaik virüsü ilk önce izole edildi ve tütün yapraklarına geçti, burada bireysel enfeksiyon lekeleri, daha sonra virion2 olarak tanımlanan tek, canlı bir virüs varlığından2 kaynaklandığı ve ölçülebildi. Daha sonra bakteri ve bakteriyofajlarla yapılan seminal çalışmalar, büyümenin orta log fazındaki bakteriler, bakteriyofaj örneklerinin seri seyreltilmesi ve bakteri çimindeki gerçek deliklerin (adlandırılmış plaklar) daha sonra görselleştirilmesiyle üst agar da dahil olmak üzere bu virüsleri plak altına almak için kullanılan teknikleri mükemmelleştirmiştir3.
Hayvan virüslerinin yutulması, bakteriyofajlarla yapılan heyecan verici araştırmaların gerisinde kaldı, çünkü esas olarak kültürde memeli hücrelerinin yetiştirilmesi için gerekli yöntemler 1940’lara kadar geliştirilmedi4. Bununla birlikte, tüm konakçı organizmanın yokluğunda büyüyen murin hücrelerinin ortaya çıkışı4, virüsleri kültürleme ve sayma yeteneğinde yeni bir çağ yarattı. Bu tür çalışmalar, tavuk hücrelerinde Batı Atı Ensefalomiyelit virüsünün ve insan hücrelerinde poliovirüsün yayılması ve kantitasyonu için genişletilmiştir5,6. Kültürlenebilir memeli hücreleri alanı genişledikçe, çeşitli viral enfeksiyonlar için farklı konakçı hücrelerin kıskançlığı, dünyaya her türlü virüsü incelemek için bir dizi olanak sağladı7. Bu, insan herpes virüslerinin, özellikle de mukokutanöz lezyonlara neden olan herpes simpleks virüsü-1 (HSV-1) ve -2’nin (HSV-2) yayılmasını ve miktarını içeriyordu8. Önemli olarak, tüm plak tahlilleri, konakçı hücrelere bir numunede reseptör aracılı bir şekilde girebilen canlı viryonların varlığına bağlıdır9. Plaket tahlillerinin yürütülmesiyle ilgili yayınların yaygınlığı ve çokluğundan bağımsız olarak5,10,11,12,13,14,15,16, HSV-1/-2 için bu yöntemler hem sanatın hem de bilimin bir karışımıdır; Protokoldeki her ayrıntıya dikkat edilmeden tahlil yapılamayacağı gibi, süreçteki incelik için kritikal bir göz olmadan da başarılı bir tahlil yapılamaz. Bu el yazması, HSV-1/-2 plak tahlilleri için en tutarlı tekrarlanabilir yöntemlerden birini, nadiren tartışılan tahlil sanatına yönelik kesin ayrıntılarla tasvir etmektedir.
Bu mevcut protokol, HSV-1 ve -2 için canlı plak oluşturan birimler (PFU) sayımlarını güvenilir bir şekilde elde eder. En iyi sonuçlar, düşük pasajda (pasaj numarası 155’in altında) Vero hücreleri (dönüştürülmüş Afrika yeşil maymun böbrek epitel hücreleri) kullanılarak elde edilir ve% 10 fetal buzağı serumu (FCS), L-alanil-L-glutamin ve bir antibiyotik / antimikotik karışım ile desteklenmiş alfa-MEM17’de rutin olarak yetiştirilir18. Vero hücreleri, bu ortamda haftada iki ila üç kez, her seferinde 1/5 seyreltmede standart olarak çoğaltılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plak tahlilleri neredeyse memeli hücre kültürünün kendisi kadar eski olsa da, her laboratuvarın bu temel tahlili yürütmek için kendi protokol setine sahip olduğu görülmektedir5,6,10,11,12,13,14,15,16,20</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuvarlarımızdaki (PJD ve BJM) bu yöntemleri geliştiren yıllar boyunca bizimle birlikte çalışan sayısız öğrenciye teşekkür ederiz. Vesayeti altında bu metodolojinin ilk geliştirildiği Stan Person’a özel bir teşekkür. Bu çalışma kısmen Towson Üniversitesi Fisher Bilim ve Matematik Lisans Araştırma Destek Fonu ve NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264 tarafından desteklenmiştir. Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü’nün resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. . Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).
- Mahy, B., Collier, L. . Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. . Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of ‘Right and Wrong Cases’ (Constant Stimuli) without Gauss’s formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
