Presentamos un protocolo experimental y un flujo de trabajo de análisis de datos para realizar espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color de células vivas (FCCS) combinada con transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) para estudiar la dinámica de los receptores de membrana en células vivas utilizando técnicas modernas de etiquetado de fluorescencia.
Presentamos un protocolo y un flujo de trabajo para realizar espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color de células vivas (FCCS) combinada con transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) para estudiar la dinámica de los receptores de membrana en células vivas utilizando técnicas modernas de etiquetado de fluorescencia. En fccs de doble color, donde las fluctuaciones en la intensidad de la fluorescencia representan la “huella digital” dinámica de la biomolécula fluorescente respectiva, podemos sondear la codifusión o la unión de los receptores. FRET, con su alta sensibilidad a las distancias moleculares, sirve como un conocido “nanoruler” para monitorear los cambios intramoleculares. En conjunto, los cambios conformacionales y los parámetros clave, como las concentraciones de receptores locales y las constantes de movilidad, se vuelven accesibles en entornos celulares.
Los enfoques de fluorescencia cuantitativa son un desafío en las células debido a los altos niveles de ruido y la vulnerabilidad de la muestra. Aquí mostramos cómo realizar este experimento, incluidos los pasos de calibración utilizando βreceptor2-adrenérgico (β2AR) etiquetado con eGFP y SNAP-tag-TAMRA. Se proporciona un procedimiento de análisis de datos paso a paso utilizando software de código abierto y plantillas que son fáciles de personalizar.
Nuestra guía permite a los investigadores desentrañar las interacciones moleculares de biomoléculas en células vivas in situ con alta confiabilidad a pesar de los niveles limitados de señal a ruido en experimentos con células vivas. La ventana operativa de FRET y particularmente FCCS a bajas concentraciones permite el análisis cuantitativo en condiciones casi fisiológicas.
La espectroscopia de fluorescencia es uno de los principales métodos para cuantificar la dinámica de proteínas y las interacciones proteína-proteína con una perturbación mínima en un contexto celular. La espectroscopia de correlación de fluorescencia confocal (FCS) es uno de los métodos poderosos para analizar la dinámica molecular, ya que es sensible a una sola molécula, altamente selectiva y compatible con células vivas1. En comparación con otros enfoques orientados a la dinámica, FCS tiene un rango de tiempo medible más amplio que abarca desde ~ ns hasta ~ s, lo más importante es que cubre las escalas de tiempo rápidas que a menudo son inaccesibles por métodos basados en imágenes. Además, también proporciona selectividad espacial para que la dinámica molecular de membrana, citoplasma y núcleo se pueda distinguir fácilmente 2. Por lo tanto, el parpadeo molecular, la concentración local promedio y el coeficiente de difusión se pueden analizar cuantitativamente con FCS. La dinámica intermolecular, como la unión, se vuelve fácilmente accesible cuando se sondea la codifusión de dos especies moleculares en el análisis de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS)3,4,5 en un enfoque de doble color.
El principal principio subyacente en la espectroscopia de correlación es el análisis estadístico de las fluctuaciones de intensidad emitidas por biomoléculas marcados fluorescentemente que se difusen dentro y fuera de un foco láser(Figura 1A). Las funciones de correlación automática o cruzada resultantes se pueden analizar más a fondo mediante el ajuste de curvas para eventualmente derivar las constantes de tasa de interés. En otras palabras, los métodos estadísticos FCS y FCCS no proporcionan trazas de una sola molécula como en el seguimiento de una sola partícula, sino un patrón dinámico o “huella digital” de una muestra sondeada con alta resolución temporal. Cuando se combina con la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), la dinámica intramolecular, como los cambios conformacionales, se puede monitorear al mismo tiempo en una configuración confocal común5,6. FRET sondea la distancia de dos fluoróforos y a menudo se conoce como un “nanoruler” molecular. La transferencia de energía tiene lugar solo cuando las moléculas están muy cerca (< 10 nm), el espectro de emisión del donante se superpone significativamente con el espectro de absorción de la molécula aceptora, y la orientación dipolar del donante y el aceptor es (suficientemente) paralela. Por lo tanto, la combinación de FRET y FCCS proporciona una técnica con una resolución espacio-temporal muy alta. Cuando se requiere selectividad espacial, sensibilidad y compatibilidad con células vivas, FRET-FCCS tiene una ventaja obvia sobre otros métodos como la calorimetría de titulación isotérmica (ITC)7,la resonancia de plasmón de superficie (SPR)8o la resonancia magnética nuclear (RMN)9,10 para medir la dinámica y las interacciones de proteínas.
A pesar de las capacidades y la promesa de la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color (dc-FCCS), la realización de dc-FCCS en células vivas es técnicamente desafiante debido al sangrado espectral o diafonía entre los canales3,4,la diferencia en los volúmenes confocales debido a las líneas láser espectralmentedistintas3,4,11,señal de fondo y ruido o fotoestabilidad limitada de las muestras12, 13,14,15. La introducción de la excitación intercalada por pulsos (PIE) en FCCS fue un ajuste importante para desacoplar temporalmente las diferentes excitaciones láser para reducir la diafonía espectral entre los canales16. Otros métodos de corrección para contrarrestar el sangrado espectral17,18,19 y las correcciones de fondo también han sido bien aceptados17,18,19. Para detalles y conceptos básicos sobre FCS, PIE o FRET, se remite al lector a las siguientes referencias2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Aquí, se presentan todos los experimentos y análisis de calibración necesarios junto con los resultados experimentales de un receptor prototípico acoplado a proteína G, β receptor 2-adrenérgico (β2AR), para tres escenarios diferentes: (1) moléculas mono-etiquetadas que llevan un fluoróforo “verde” (eGFP) o “rojo” (etiquetado basado en etiqueta SNAP)25; (2) una construcción de doble etiqueta, que lleva una etiqueta SNAP N-terminal y eGFP intracelular (NT-SNAP) [en este caso, ambas etiquetas están en la misma proteína. Por lo tanto, se espera una co-difusión del 100%]; y (3) una muestra de doble marca, donde ambos fluoróforos están en el mismo lado de la membrana celular (CT-SNAP). Lleva una etiqueta SNAP-terminal C y una eGFP intracelular. Aquí, de nuevo, ambas etiquetas están en la misma proteína con de nuevo 100% de co-difusión esperada. Como ambas etiquetas están muy cerca una de la otra, en el mismo lado de la membrana celular, muestra el potencial para observar el FRET y el comportamiento anticorrelacionado. Todos los constructos fueron transfectados en células de ovario de hámster chino (CHO) y luego etiquetados con un sustrato fluorescente rojo que es impermeable a la membrana para la construcción NT-SNAP y permeable a la membrana para la construcción CT-SNAP. Finalmente, los datos simulados ejemplifican la influencia de los parámetros experimentales en la anticorrelación inducida por FRET y el efecto de las interacciones proteína-proteína en la amplitud de co-difusión.
Por lo tanto, este protocolo proporciona una guía completa para realizar el FRET-FCCS combinado en células vivas para comprender la dinámica de las proteínas y las interacciones proteína-proteína, al tiempo que toma conciencia de los artefactos técnicos / físicos, los desafíos y las posibles soluciones.
Las técnicas FCS en GPCRs permiten evaluar la movilidad e interacciones de los receptores dentro de las células vivas41. La ventaja de la técnica FRET-FCS es que, junto con la movilidad, se puede investigar la dinámica conformacional de los GPCR. Sin embargo, realizar FRET-FCS en células vivas es un desafío y requiere células que muestren una expresión baja (o máxima moderada) de la proteína de interés etiquetada fluorescentemente, una configuración bien calibrada y una buena tubería para analizar los datos. Aquí, primero se discuten los puntos críticos en la preparación de la muestra y el procedimiento experimental con respecto a los puntos de vista biológicos, espectroscópicos y técnicos.
Los pasos experimentales críticos incluyen minimizar el fondo y la autofluorescencia (mediante el uso de cubiertas ampliamente limpias y medios libres de rojo fenol), la optimización de las condiciones de transfección (por ejemplo, la cantidad de ADN plásmido y el tiempo después de la transfección) para lograr bajos niveles de expresión y un etiquetado eficiente. Por supuesto, también es vital asegurarse de que la función de la proteína etiquetada no se vea obstaculizada. Por lo tanto, en experimentos con células vivas, la decisión de la estrategia de etiquetado y la posición de la etiqueta a menudo se toma a favor de las proteínas fluorescentes o la etiqueta SNAP / CLIP unida al extremo flexible N o C42,43. Estrategias alternativas de etiquetado como la inserción de un aminoácido no natural con una cadena lateral reactiva para el etiquetado con un fluoróforo orgánico han ido surgiendo en los últimos años44.
Para PIE-FCS de doble color, donde solo se debe investigar la interacción de dos moléculas de interés, los fluoróforos se pueden seleccionar de una gran variedad de proteínas fluorescentes establecidas o sustratos SNAP / CLIP. Aquí, en cuanto a la espectroscopia, el objetivo debe ser seleccionar un par de tal manera que se produzca poca diafonía o excitación aceptora directa. Además, los fluoróforos seleccionados deben ser fotoestables y mostrar poco o ningún blanqueamiento en las condiciones experimentales elegidas. Se recomienda seleccionar fluoróforos en el rango espectral rojo ya que (1) el fondo de autofluorescencia de la célula se reduce y (2) la luz de excitación es de longitud de onda más larga, por lo tanto menos fototóxica14. El fotobleaching se puede minimizar realizando primero una llamada “serie de potencia”, en la que la potencia del láser se incrementa paso a paso y se observa el brillo molecular. El rango óptimo de intensidad de excitación se encuentra en el rango lineal de los resultados45.
Si se supone que las dos etiquetas informan también sobre la dinámica conformacional de las proteínas a través de FRET, entonces la elección de los fluoróforos disponibles es más restringida. Aquí, la posible distancia mínima /máxima entre los dos fluoróforos debe estimarse de antemano, por ejemplo, en función de las estructuras disponibles o el tamaño molecular, y un par de fluoróforos seleccionado con un radio de Förster R 0 razonable tal que FRET pueda ocurrir realmente20.
Aquí, se eligió eGFP y una etiqueta SNAP para el etiquetado, y la etiqueta SNAP se etiquetó con un sustrato de superficie intracelular o impermeable a la membrana. Los espectros son similares a los que se muestran en la Figura 2C-D. Esta combinación de fluoróforos muestra una alta diafonía del eGFP en los canales de detección rojos y la excitación aceptora directa del sustrato SNAP por la excitación verde en la ventana de tiempo rápida y da como resultado una señal “falsa” significativa en los canales rojos en la ventana de tiempo rápida. Idealmente, ambos valores, la diafonía y la excitación del aceptor directo, no deben exceder el 5%5,6,38. Sin embargo, con un radio de Förster de 57 Å, es ideal para sondear la distancia entre las etiquetas en el β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP como se puede evaluar a partir de la vida útil de eGFP apagada (Nota suplementaria 5).
Técnicamente, como para cualquier experimento de espectroscopia de fluorescencia, el dispositivo debe estar bien alineado y debe poseer fuentes de excitación adecuadas, filtro de emisión y detectores sensibles. Para evitar artefactos del postpulso del detector en la escala de tiempo μs, deben estar presentes al menos dos detectores de cada color, que pueden estar correlacionados entre sí. En la electrónica moderna de conteo de fotón único correlacionada con el tiempo, el tiempo muerto de la tarjeta de detección en el rango de tiempo ns apenas juega un papel debido a los canales de enrutamiento independientes, sin embargo, podría verificarse como lo proponeN Müller et al 16 siempre que el rango de tiempo de interés se encuentre en el rango de tiempo sub-μs / ns. Además, para resoluciones de tiempo aún más altas en el rango ps, cada canal de detección debe duplicarse, es decir, se deben usar cuatro detectores por color, para evitar también los tiempos muertos del detector2,15,29,46. Si bien la vida útil promedio de la fluorescencia se puede estimar utilizando la detección de fluorescencia no polarizada, para el análisis de la distancia (~ distribución) entre los fluoróforos, la emisión debe recogerse dependiendo de la polarización. Esto se debe al hecho de que la eficiencia de la transferencia de energía en FRET se basa en la orientación de los dos fluoróforos. Información más detallada se puede encontrar aquí20,28,47. Finalmente, en los experimentos PIE, la distancia entre el pulso de aviso y retardo es crítica y debe elegirse de tal manera que la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos se haya descompuesto en gran medida(Figura 1B). Una regla común es colocar los dos pulsos 5 veces la vida útil de fluorescencia aparte, es decir, para eGFP con una vida útil de fluorescencia de 2.5 ns la distancia debe ser de 12.5 ns como mínimo22.
Después de haber detallado todas las consideraciones para el procedimiento experimental, los datos y su análisis se discuten con más detalle. Como se mencionó en la sección de protocolo, la alineación de la configuración debe verificarse diariamente, incluido el análisis de las mediciones de calibración. Los datos mostrados en la Figura 2A-C, por ejemplo, muestran un componente de relajación adicional en el rango de 8-40 μs. Se sabe que el parpadeo típico del fluoróforo de calibración verde ocurre en el rango de 2-10μs 13,15,48. El componente de relajación lenta requerido en todas las curvas de la muestra de ADN(Figura 3C),demasiado lento para el parpadeo real del triplete, podría provenir de las interacciones del ADN con los fluoróforos39. Sin embargo, este componente no se esperaría en CCFPIE,y lo más probable es que provena de la diafonía residual. Por lo tanto, es muy recomendable realizar el análisis de las muestras de calibración directamente antes de proceder a los experimentos celulares para juzgar la calidad de la alineación del día.
La calibración adecuada del volumen de superposición confocal requiere una muestra con 100% de co-difusión de la etiqueta verde y roja. Aquí, se utiliza ADN de doble cadena etiquetado fluorescentemente. Ambas hebras de ADN se pueden adaptar para tener los fluoróforos deseados a la distancia requerida entre sí. Las hebras diseñadas se pueden reconar con alto rendimiento. Sin embargo, Good Laboratory Practice aconseja verificar la integridad y el grado de etiquetado de las hebras de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa y medir el espectro de absorción. Además, se debe verificar el rendimiento del conjunto de doble cadena, ya que esta medición de calibración se basa críticamente en la suposición de que hay una co-difusión del 100% del verde con la etiqueta roja. En caso de que el supuesto no sea válido, los factores de corrección podrían tener que aplicarse16,22. En las mediciones de calibración mostradas en la Figura 2 y figura 3,se obtuvo un volumen de detección de 1,4 fL y 1,9 fL en el canal verde y rojo, respectivamente. Esta diferencia de tamaño se espera para una configuración con volúmenes de excitación casi limitados por difracción (Nota suplementaria 2). Bajo esta condición, el tamaño del volumen de excitación escala con la longitud de onda de excitación. Esto a su vez explica las diferentes amplitudes de correlación observadas en la Figura 3B. Los factores de corrección derivados r GR = 0,56 y rRG = 0,72 corrigen esta discrepancia de tamaño y posible superposición no perfecta de los dos volúmenes de excitación3,4.
La Figura 4, la Figura 5, la Figura 6y la Figura 7 muestran el flujo de trabajo de un estudio basado en PIE-F(C)CS destinado a comprender la dinámica de proteínas conformacionales. En primer lugar, las dos construcciones monoeticadas β2AR-IL3-eGFP y NT-SNAP-β2AR sirven como controles para caracterizar las propiedades del fluoróforo en las células en ausencia del otro fluoróforo respectivo(Figura 4). A continuación, la construcción de doble etiqueta NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP que lleva una etiqueta SNAP frente al exterior de la célula y una eGFP en el lado citoplasmático sirve como un control de “co-difusión del 100%”(Figura 5). El último constructo, β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, lleva ambos fluoróforos en el lado citoplasmático y lo suficientemente juntos como para someterse a FRET. Aquí, nuevamente se esperaría una co-difusión del 100% en conjunto con fluctuaciones de intensidad anti-correlacionadas en la señal de los canales verde y rojo en la ventana de tiempo rápida, es decir, después de la excitación del donante, debido a la dinámica de la proteína que influye en la eficiencia FRET31,32,33. Esta dinámica podría aparecer como anticorre correlación en el FRET del CCF (Figura 6-7).
Todos los constructos GPCR β2AR muestran difusión bimodal en la membrana celular(Figura 4A). Mientras que el β2AR-IL3-eGFP muestra solo el parpadeo del triplete esperado(Figura 5B)13,15, NT-SNAP-β2AR muestra un tiempo de relajación lento adicional (Figura 5C-D). Es probable que tR2 pueda provenir de un sustrato SNAP no unido. Esto podría dilucidarse mediante experimentos adicionales, por ejemplo, midiendo también la difusión y las propiedades fotofísicas del sustrato SNAP utilizado en una solución acuosa. Cabe destacar que un experimento sencillo para diferenciar entre tiempos de difusión y relajación es cambiar el agujero de alfiler de la configuración confocal, es decir, aumentar el volumen efectivo: mientras que los tiempos de difusión aumentan con el aumento de los volúmenes efectivos, los términos de relajación no se modifican13. A la hora de determinar la concentración de proteína fluorescente (FP) en base a los resultados de ajuste, tenga en cuenta que los FP en general se someten a un proceso de maduración, en el que finalmente se forma el cromóforo12. Este tiempo de maduración puede diferir de FP a FP además de la fotofísica que depende del entorno químico local13,15. Por lo tanto, la concentración real de proteínas presente en la muestra reportada por FCS generalmente se subestima, lo que puede corregirse si se puede determinar la fracción de FP no fluorescentes en el experimento. Por último, es recomendable comprobar los espectros de fluoróforos en células vivas para corregir los valores de α y δ, si es necesario, ya que la mayoría de los fluoróforos reaccionan sensibles a su entorno13,15,48. El fondo a restar está determinado por la señal recogida en células no transfectadas. Además, se debe verificar la autocorrelación del otro canal de color respectivo y el CCF PIE para poder identificar señales falsas(Nota complementaria 4 – Figura 30).
Las dos mediciones del NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP(Figura 5D),donde los fluoróforos se encuentran en diferentes lados de la membrana, se adquirieron en diferentes días y muestran la importancia de la estadística en la fluorescencia de molécula única resuelta en el tiempo. Aquí, los diferentes resultados pueden deberse al diferente grado de etiquetado: en una celda, el mayor grado de etiquetado y promedio de las mediciones resultó en un ruido relativamente bajo(Figura 5B),mientras que en la otra celda, solo se pudieron recopilar dos mediciones(Figura 5A). Más allá de recopilar una cantidad suficiente de datos, es fundamental evaluar los resultados a tiempo y tal vez optimizar la estrategia de etiquetado. Al diseñar los experimentos, es importante recordar que FRET es sensible, pero limitado a distancias de hasta 10 nm y “ciego” de lo contrario. En nuestro caso, esta “ceguera” está indicada por la vida útil de fluorescencia eGFP inalterada (Nota complementaria 5). En la construcción β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(Figura 6A),FRET se puede identificar a partir de la vida útil de eGFP apagada (Nota complementaria 5). Sin embargo, no se observa ningún término de anticorrelación(Figura 6B),lo que significa que FRET no fluctúa o en una escala de tiempo más lenta que el tiempo de difusión. Se requieren hasta tres términos de relajación adicionales en ACFgp, ACFrp, ACFrd y CCFFRET (Figura 6C). El componente lento en ACFrp, ACFrd y CCFFRET podría deberse al blanqueamiento del aceptor y, por supuesto, influye en el valor obtenido de la difusión lenta que se encuentra en estas curvas (~350 ms en comparación con 117 ms en ACFgp). Se supone que tD en el canal rojo es ligeramente más grande que en el canal verde debido a los volúmenes confocales de diferentes tamaños (Figura 2), pero solo por un factor comparable a la diferencia de tamaño. El tiempo de relajación muy rápido de 3 μs refleja el parpadeo triplete de los fluoróforos13,15,48,mientras que el tiempo de relajación más lento de 37 μs podría deberse a FRET: Del mismo modo, como FRET induce una anticorrelación en el FRETCCF,se esperan correlaciones positivas en las autocorrelaciones31,32,33. La presencia de este término como “positivo” en elFRET del CCF y su presencia en el ACFrd podría explicarse con la diafonía alta y debería dilucidarse más a fondo. Tenga en cuenta que el PIE del CCF es plano en tiempos de correlación cortos como se esperaba.
Por otro lado, cabe señalar que la ocurrencia de FRET en un sistema de interés conduce a efectos no lineales sobre las curvas de correlación6. El brillo molecular, por ejemplo, de una molécula escala en la amplitud de correlación al cuadrado y cada estado FRET (y las moléculas siempre presentes sin un receptor activo) muestra un brillo molecular diferente. De hecho, FRET disminuye la concentración aparente de moléculas verdes detectadas (es decir, aumenta la amplitud de ACFgp) y el número de moléculas rojas (determinado a partir de la indicación roja) se sobreestima5. Ambos efectos influyen en la cantidad de interacción derivada tanto de CCFFRET como de CCFPIE. Sin embargo, el análisis global como se muestra, por ejemplo, para la dinámica intramolecular de Calmodulina 31,32 o Sintaxina33 puede revelar la dinámica de la proteína. Cuando se calibra cuidadosamente, la eficiencia media de FRET puede extraerse de las amplitudes relativas CCFPIE y ACF22, mientras que los estados limitantes pueden determinarse a partir del análisis de la distribución de la vida útil de la fluorescencia del donante33.
Teniendo en cuenta el hecho de que en experimentos de células vivas con fluoróforos grandes como eGFP es probable que el contraste FRET sea incluso más bajo de lo que se supone para las simulaciones mostradas en la Figura 6 y que la excitación directa del aceptor no se agregó en la simulación, podría explicar por qué la identificación de la anticorrelación en experimentos con células vivas es muy desafiante. Una alternativa de análisis prometedora se basa en la recolección de la información codificada en los histogramas de tiempo de llegada de fotones(Figura 1B)accesibles debido a la recopilación de datos de conteo de fotón único correlacionados en el tiempo29,30. Si se conoce la vida útil de fluorescencia (~patrones) de las dos (o más) especies (FRET) dentro de la muestra(Figura 7A),se puede elegir “filtro” o pesos que se aplican durante el proceso de correlación(Figura 7B)17,18,19. Las curvas de correlación así obtenidas, ya no representan la correlación de los canales de detección, sino más bien las correlaciones automáticas o cruzadas entre dos especies diferentes (FRET), por lo que se renombran a especie-ACF (sACF) o especie-CCF (sCCF). Aplicando este enfoque a los datos simulados con contraste FRET moderado, diafonía alta y parpadeo triplete recupera el término anticorrelación(Figura 7C-D). Sin embargo, cabe destacar que se pueden obtener tiempos de relajación pero se pierde la relación con la amplitud18. Este enfoque se ha aplicado previamente en experimentos de células vivas, por ejemplo, para estudiar la interacción de EGFR con su antagonista49 o para separar la fluorescencia de las proteínas unidas a variantes de eGFP con vidas de fluorescencia excepcionalmente cortas y largas50.
Mientras que las mediciones FRET basadas en PIE en proteínas purificadas se utilizan en gran medida para estudiar la dinámica deproteínas 3622, en células vivas se centra en comprender las interacciones proteína-proteína. Este enfoque se ha aplicado para estudiar la regulación de la actividad de la MAP quinasa enlevaduras 51 o para resolver la interacción de las proteínas de membrana con su compañero de unión citosólica como se resume en este reciente artículo52. Aquí, pueden surgir complicaciones cuando la diafonía significativa de fluoróforos verdes todavía está presente en la ventana de tiempo de retraso de los canales rojos o la señal roja en los canales verdes en la ventana de tiempo rápida. El primero podría ser causado por un retraso insuficiente del pulso rojo con respecto al pulso verde, mientras que ambos efectos se derivan de espectros de excitación y emisión demasiado fuertemente superpuestos de los fluoróforos elegidos. Se recomienda verificar cuidadosamente las respectivas construcciones de una sola etiqueta y corregir las amplitudes PIE de CCF falsos positivos, especialmente en células donde la autofluorescencia con una vida útil de fluorescencia muy corta podría ser otro factor complicado22.
Para concluir, el enfoque FRET-FCS descrito aquí tiene un gran potencial para comprender las interacciones proteína-proteína y la dinámica de proteínas en células vivas a concentraciones casi fisiológicas. En este protocolo, se centró en las mediciones de calibración requeridas y el análisis cuantitativo necesario que se realizará durante las mediciones de células vivas. Con este fin, se mostraron diferentes mediciones de células vivas complementadas con simulaciones. Las simulaciones proporcionan la comprensión general aquí, ya que el parámetro podría variarse sistemáticamente con modelos de ajuste personalizados que describen la movilidad específica y las propiedades fotofísicas de los datos respectivos. El análisis se realizó con herramientas de software de código abierto con un extenso protocolo paso a paso y plantillas fáciles de adaptar. Finalmente, los avances técnicos y, por lo tanto, la disponibilidad de sistemas PIE-FCS estables listos para comprar, junto con la difusión de software de código abierto para el análisis de datos, harán que esta técnica sea cada vez más accesible para una comunidad de investigación más grande para eventualmente desentrañar la interacción y la dinámica de las proteínas en células vivas con la mayor sensibilidad.
The authors have nothing to disclose.
Este proyecto fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, número de proyecto 374031971, Proyecto INF) a J.B. y K.G.H.
Agradecemos al Centro Rudolf Virchow por el apoyo financiero y a Core Unit Fluorescence Imaging por el apoyo técnico. Además, agradecemos a Ashwin Balakrishnan por una completa revisión.
1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
Biorender (Software) | Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada) | — | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | — | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
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DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | — | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
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Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | — | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |