In situ Hibridização em Larvas de Zebrafish e Juvenis durante o Desenvolvimento de Mesonephros
Summary
O zebrafish é um modelo importante para entender o desenvolvimento renal. Aqui, um protocolo de hibridização in situ é otimizado para detectar expressão genética em larvas de zebrafish e juvenis durante o desenvolvimento de mesonepros.
Abstract
O zebrafish forma duas estruturas renais em sua vida. Os pronephros (rim embrionário) formam-se durante o desenvolvimento embrionário e começam a funcionar a 2 dias após a fertilização. Composto por apenas dois nefrões, os glifos servem como rim único durante a vida larval até que mais função renal seja necessária devido ao aumento da massa corporal. Para lidar com essa maior demanda, os mesonepros (rim adulto) começam a se formar durante a metamorfose. Os novos nefrons primários se fundem aos glifos e formam lúmens conectados. Em seguida, nefrões secundários se fundem aos primários (e assim por diante) para criar uma rede de ramificação nos mesonephros. A grande maioria das pesquisas está focada nos dispositivos proviros devido à facilidade de uso de embriões. Assim, é necessário desenvolver técnicas para estudar larvas mais antigas e maiores e peixes juvenis para entender melhor o desenvolvimento de mesonepros. Aqui, um protocolo de hibridização in situ para análise de expressão genética é otimizado para penetração de sondas, lavagem de sondas e anticorpos, e branqueamento de pigmentos para melhor visualizar os mesonephros. A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) é usada para rotular células progenitoras e os túbulos distais de nefrrons nascentes. Este protocolo preenche uma lacuna na pesquisa de mesonepros. É um modelo crucial para entender como os novos tecidos renais se formam e se integram com os nefrões existentes e fornecem insights sobre terapias regenerativas.
Introduction
O embrião de zebrafish é um modelo importante para estudar o desenvolvimento de tecidos devido ao seu pequeno tamanho, transparência, ferramentas disponíveis e sobrevivência sem se alimentar por até cinco dias1,2. Contribuiu muito para a compreensão do desenvolvimento renal e da conservação entre zebrafish e mamíferos3,4,5. O rim desempenha um papel essencial na manutenção da homeostase fluida, filtrando o sangue e excretando resíduos6. O nefron, a unidade funcional do rim, compreende um filtro sanguíneo conectado a um túbulo longo. Em zebrafish, duas estruturas renais se formam ao longo de sua vida. Os pronephros (o rim embrionário temporário) formam-se primeiro durante o desenvolvimento precoce. Consiste em dois nefrões correndo ao longo do eixo anterior-posterior e torna-se funcional em cerca de 2 dias após a fertilização (dpf). A utilidade dos tubérculos está em sua simplicidade, tendo apenas dois nefrões que são em sua maioria lineares e fáceis de visualizar (embora o túbulo proximal convolutado comece a enrolar em três dpf)3. Isso facilitou não apenas estudos de seu desenvolvimento precoce a partir do mesoderm intermediário, mas também do padrão de segmentação e reparo de túbulos7,8.
A utilidade do zebrafish torna-se limitada após cinco dpf, quando a gema é diminuída e as larvas dependem da alimentação no sistema aquático9. Com cerca de 2 semanas de idade, as larvas passam por metamorfose em juvenis, onde novos tecidos se formam e tecidos antigos são perdidos e/ou reorganizados9. É também quando os mesonephros (o rim adulto permanente) formam 10,11,12. O primeiro nefron adulto forma-se perto do sexto somite, e funde-se com o túbulo distal precoce dos tubérculos. Nephrons adicionais são adicionados posteriormente a esta posição inicialmente, mas também para o anterior mais tarde. Os néfirons primários nesta primeira onda se fundem aos túbulos dos tubérculos e compartilham um lúmen comum para depositar seus resíduos. Nefrões secundários formam-se na próxima onda e fundem-se aos nefrões primários. Este processo reiterativo cria um mesonepros que é ramificado, um pouco semelhante ao rim mamífero. Presumivelmente, os tubérculos eventualmente perdem sua identidade túbula e se tornam dois grandes dutos coletores onde todos os nefrões drenam seus resíduos13.
Antes da formação do primeiro nefron adulto, células progenitoras únicas começam a aparecer em larvas de ~4 mm (comprimento total) (~10 dpf). Essas células, que estão marcadas na linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP), aderem aosphros propensos e parecem migrar para futuros locais de nefrogenese. As células únicas se fundem em aglomerados, que se diferenciam em novos nefrões12. Não está claro onde essas células residem ou quais genes elas expressam antes do início da mesonofrogenese.
Compreender o desenvolvimento de mesonephros fornece insights sobre o rim mamífero de maneiras que os pronephros não podem. Estes incluem a formação de agregados nefrogenicos a partir de células progenitoras únicas, integração funcional de novos nefrões com os existentes, e morfogênese ramificada. No entanto, há limitações para estudar o desenvolvimento pós-cisônico. As larvas são menos transparentes devido ao seu tamanho maior e ter pigmentação. O cronograma de desenvolvimento não é síncronto entre os animais individuais e é altamente dependente de fatores ambientais, como alimentação e aglomeração de 9,14. Embora os reagentes de knockdown existam, eles são menos eficazes em larvas em comparação com embriões15. Neste protocolo, é descrito um método de hibridização in situ para determinar a expressão genética durante o desenvolvimento de mesonepros de zebrafish. Várias etapas são otimizadas para aumentar a visualização dos mesonephros e penetração e lavagem da sonda e anticorpo. A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) é usada juntamente com uma sonda para EGFP para rotular células progenitoras únicas, agregados nefrogenicos e os túbulos distais de nefrrons nascentes. Este método fornecerá uma compreensão mais profunda do desenvolvimento de mesonepros e uma visão sobre terapias regenerativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de hibridização in situ descrito aqui visa estudar o desenvolvimento de mesonepros. No entanto, pode ser aplicado para estudar o desenvolvimento de outros tecidos e órgãos durante a metamorfose, como intestino, sistema nervoso, escamas e pigmentação14. Sondas podem ser geradas para genes endógenos ou marcadores fluorescentes em linhas transgênicas.
É fundamental que as larvas permaneçam intactas para observar os órgãos e tecidos em seu con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento foi fornecido pela Academia de Ciências da Pensilvânia, e pela Comunidade de Biólogos da Pensilvânia, e pela Universidade de Indiana da Pensilvânia (Escola de Pós-Graduação e Pesquisa, Departamento de Biologia e Pelo Fundo de Biologia de Graduação Cynthia Sushak para Excelência). A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) foi fornecida pelo Dr. Neil Hukriede (Universidade de Pittsburgh).
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
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