Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato
Summary
Este protocolo descreve uma abordagem eficiente e reprodutível para estudos histológicos cerebrais do camundongo, incluindo perfusão, seção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem.
Abstract
A coloração imunohistoquímica do cérebro de camundongos é uma técnica de rotina comumente usada na neurociência para investigar mecanismos centrais subjacentes à regulação do metabolismo energético e outros processos neurobiológicos. No entanto, a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados da histologia cerebral podem variar entre os laboratórios. Para cada experimento de coloração, é necessário otimizar os procedimentos-chave baseados em diferenças de espécies, tecidos, proteínas direcionadas e condições de trabalho dos reagentes. Este artigo demonstra um fluxo de trabalho confiável em detalhes, incluindo perfusão intra-aórtica, seção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem, que podem ser seguidos facilmente por pesquisadores neste campo.
Também são discutidos como modificar esses procedimentos para satisfazer as necessidades individuais dos pesquisadores. Para ilustrar a confiabilidade e eficiência deste protocolo, as redes perineuronas foram manchadas com wisteria florbunda agglutinina (WFA) e vasopressina arginina (AVP) com um anticorpo anti-AVP no cérebro do rato. Finalmente, os detalhes críticos de todo o procedimento foram abordados, e as vantagens deste protocolo em comparação com os de outros protocolos. Juntos, este artigo apresenta um protocolo otimizado para a imunostaining flutuante livre do tecido cerebral do rato. Seguir este protocolo torna esse processo mais fácil para cientistas juniores e seniores melhorarem a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade dos estudos de imunossuagem.
Introduction
A prevalência de obesidade e comorbidades associadas atingiu níveis epidêmicos, causando uma tremenda carga socioeconômica1,2. Vários modelos de camundongos foram desenvolvidos para entender melhor os processos biológicos responsáveis pela obesidade3,4. Como os mecanismos centrais são importantes para a regulação da homeostase energética nesses modelos animais, estudos neuroanatomômicos de cérebros de camundongos tornaram-se uma técnica necessária neste campo. No entanto, a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade das técnicas de histologia cerebral variam consideravelmente entre laboratórios e até pesquisadores dentro do mesmo laboratório por várias razões (por exemplo, anticorpos, tecidos, tratamentos, espécies, objetivos de pesquisa). Portanto, é necessário estabelecer um protocolo geral para estudos histológicos do cérebro do camundongo, incluindo perfusão, secção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecidos e imagem. Enquanto isso, os iniciantes podem aprender, dominar e ajustar rapidamente este protocolo para satisfazer suas necessidades individuais.
A coloração imunohistoquímica é um método estabelecido que tem sido usado extensivamente para visualizar tipos de células específicas, mRNAs e proteínas em uma variedade de tecidos (por exemplo, tecidos cerebrais e periféricos)5,6. Mais especificamente, um antígeno de interesse pode ser rotulado por um anticorpo primário específico e um anticorpo secundário correspondente ligado a uma enzima (por exemplo, imunohistoquímica cromogênica) ou um corante fluorescente (isothiocyanato fluoresceína)6. Como exemplo da utilidade dessas técnicas, β-endorfina [um peptídeo codificado por pró-opiomelanocortina (POMC)) e c-fos (um marcador de atividade neuronal) foram manchados no núcleo arcuato. A exclusão da hidroxilase triptofano 2 (enzima integral à síntese de serotonina) no núcleo de raphe dorsal mostrou-se diminuir a expressão c-fos nos neurônios POMC no núcleo arcuato7. Além disso, a distribuição do receptor de vitamina D mRNA foi mapeada no cérebro do camundongo através da hibridização in situ (RNAscope)8. Este artigo apresenta um método confiável e eficiente com um fluxo de trabalho passo a passo para imunostaining flutuante livre, visando melhorar a qualidade e a reprodutibilidade dos estudos histológicos do cérebro do camundongo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece um método estabelecido para estudos neuroanatomáticos do cérebro do camundongo, incluindo perfusão, secção tecidual, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem. No entanto, alguns detalhes-chave essenciais para resultados consistentes e confiáveis devem ser otimizados.
A qualidade da perfusão é fundamental para o sucesso da coloração. Os resultados da coloração podem ser afetados se o sangue permanecer no cérebro, dado que os glóbulos sangu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os investigadores foram apoiados por subvenções do NIH (K01DK119471 à CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 e R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S para YX) e American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) para LT.
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
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