小鼠大脑的自由漂浮免疫染色
Summary
该协议描述了一种用于小鼠脑组织学研究的有效且可重复的方法，包括灌注，脑切片，自由漂浮的免疫染色，组织安装和成像。
Abstract
小鼠大脑的免疫组织化学染色是神经科学中常用的常规技术，用于研究能量代谢调节和其他神经生物学过程的潜在中枢机制。然而，脑组织学结果的质量、可靠性和可重复性可能因实验室而异。对于每个染色实验，有必要根据物种，组织，靶蛋白和试剂工作条件的差异来优化关键程序。本文详细介绍了可靠的工作流程，包括主动脉内灌注、脑切片、自由浮动免疫染色、组织安装和成像，该领域的研究人员可以轻松跟踪这些工作流程。
还讨论了如何修改这些程序以满足研究人员的个性化需求。为了说明该协议的可靠性和有效性，用生物素标记的紫藤凝集素（WFA）和精氨酸血管加压素（AVP）染色，并在小鼠大脑中用抗AVP抗体染色会阴神经网。最后，已经解决了整个过程的关键细节，以及该协议与其他协议相比的优势。综上所述，本文提出了一种用于小鼠脑组织自由漂浮免疫染色的优化方案。遵循该协议使初级和高级科学家更容易提高免疫染色研究的质量，可靠性和可重复性。
Introduction
肥胖和相关合并症的患病率已达到流行水平，造成巨大的社会经济负担1，2。已经开发了各种小鼠模型，以更好地了解导致肥胖的生物过程3，4。由于这些动物模型中的核心机制对于能量稳态的调节很重要，因此小鼠大脑的神经解剖学研究已成为该领域的必要技术。然而，由于各种原因（例如，抗体，组织，治疗，物种，研究目标），实验室甚至同一实验室内的研究人员之间的脑组织学技术的质量，可靠性和可重复性差异很大。因此，有必要为小鼠大脑的组织学研究建立一个通用方案，包括灌注，脑切片，自由漂浮的免疫染色，组织安装和成像。同时，初学者可以快速学习，掌握和调整此协议，以满足他们的个人需求。
免疫组织化学染色是一种成熟的方法，已被广泛用于可视化各种组织（例如，脑和外周组织）中的特定细胞类型，mRNA和蛋白质5，6。更具体地说，目的抗原可以通过特异性一抗和与酶（例如，显色性免疫组化）或荧光染料（荧光素异硫氰酸酯）相关联的相应二抗来标记6。作为这些技术实用性的一个例子，在弓形核中染色β内啡肽[由前阿片美皮质素（POMC）编码的肽]和c-fos（神经元活性的标志物）。背侧透明质核中色氨酸羟化酶2（5-羟色胺合成不可或缺的酶）的缺失被证明会降低弓形核中POMC神经元中的c-fos表达7。此外，通过原位杂交（RNAscope）绘制了维生素D受体mRNA在小鼠大脑中的分布图谱8。本文提出了一种可靠而有效的方法，采用分步工作流程进行自由漂浮的免疫染色，旨在提高小鼠大脑组织学研究的质量和可重复性。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议为小鼠大脑的神经解剖学研究提供了一种既定的方法，包括灌注，组织切片，自由漂浮的免疫染色，组织安装和成像。但是，必须优化一些关键细节，这些细节对于获得一致和可靠的结果至关重要。
灌注质量对于成功染色至关重要。如果血液残留在大脑中，染色结果可能会受到影响，因为血细胞（例如红细胞）可以产生人工”阳性”染色10。我们推断存?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
调查人员得到了NIH的资助（K01DK119471到CW;P01DK113954，R01DK115761，R01DK117281，R01DK125480和R01DK120858到YX），USDA / CRIS（51000-064-01S到YX）和美国心脏协会博士后奖学金（#829565）到LT。
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
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