Mesure de l’évolution temporelle des matériaux à l’échelle nanométrique avec flux arrêté et diffusion neutronique aux petits angles

La diffusion neutronique aux petits angles (SANS) offre un moyen unique de mesurer les tailles, les formes, les interactions et l’organisation de divers matériaux sur des échelles de longueur allant de ≈1 nm à ≈100 nm ^1,2,3. Les instruments récents, y compris les instruments VSANS (Very small-angle neutron scattering) avec miroirs de focalisation, repoussent les limites pour mesurer des échelles de longueur encore plus grandes jusqu’à ≈1000 nm ^4,5. En général, le contraste de diffusion unique inhérent aux méthodes de diffusion neutronique offre plusieurs avantages dans la mesure de l’évolution temporelle des structures à l’échelle nanométrique, tels que l’agrégation des composants dans les formulations pharmaceutiques⁶, les réactions de réticulation et de gélification dans les systèmes polymères^7,8, la cristallisation méso des protéines membranaires^9,10, la dégradation et le déploiement des protéines^11,12 et la croissance des matériaux à base de silice^13,14,15. Le contraste de diffusion unique fait du SAN à résolution temporelle (TR-SANS) un complément utile aux autres mesures basées sur le flux arrêté.

Les méthodes de mélange à écoulement arrêté sont souvent mises en œuvre dans la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)16,17,18,19,20,21, la spectroscopie de fluorescence 22,23,24,25,26 et la diffusion de la lumière^{27,28,29,30, 31,32} expériences pour étudier les processus cinétiques sur des échelles de temps de la milliseconde. Une différence importante entre SANS et SAXS est que la diffusion neutronique est une technique de caractérisation non destructive et, en tant que telle, SANS peut être utilisée pour mesurer le même échantillon pendant des heures, voire des jours, sans endommager l’échantillon par les rayonnements ionisants, ce qui peut se produire lors d’expériences de diffusion de rayons X à flux plus élevé³³. Comme les mesures SANS répétées ne modifieront pas la structure chimique de la molécule ou de l’échantillon de la sonde, l’évolution temporelle peut être étudiée sans effets du photoblanchiment, par exemple, ce qui peut compliquer les mesures cinétiques qui reposent sur la fluorescence^23,24. De plus, SANS peut être utilisé pour mesurer des échantillons très concentrés et optiquement opaques qui sont souvent difficiles à caractériser avec des techniques basées sur la lumière telles que la diffusion dynamique de la lumière.

En plus de fournir des informations structurelles à l’échelle nanométrique, SANS peut être utilisé pour sonder la composition locale de ces structures grâce à la variation du contraste de densité de longueur de diffusion des neutrons. La densité de longueur de diffusion (DLS) des différents éléments varie de façon aléatoire dans le tableau périodique et varie avec différents isotopes du même élément. Un exemple couramment exploité est l’hydrogène (¹H ou H) et le deutérium (²H ou D), qui ont des longueurs de diffusion des neutrons très différentes. Par conséquent, les matériaux riches en hydrogène, tels que les tensioactifs, les lipides, les protéines, l’ARN, l’ADN et d’autres polymères, peuvent être distingués des solvants deutérés à l’aide de SANS sans modifier de manière significative les propriétés physiques du système. Cependant, il est important de noter que l’échange H/D peut affecter la densité, la liaison hydrogène et les températures de transition de phase dans l’échantillon. Néanmoins, la sensibilité unique du SANS aux matériaux riches en hydrogène est particulièrement utile dans la recherche sur la matière molle où les échantillons d’intérêt ont un contraste de diffusion et un signal plus faibles dans les techniques basées sur les rayons X telles que SAXS. La substitution isotopique fait également du SANS un outil puissant pour étudier la cinétique d’échange moléculaire dans les matériaux riches en hydrogène en mélangeant simplement des molécules marquées H et marquées D. La substitution isotopique est particulièrement utile dans les systèmes où les colorants fluorescents encombrants sont plus gros que les molécules de tensioactif ou de lipides d’intérêt et peuvent influencer la cinétique d’échange^34,35.

Les mesures SANS résolues dans le temps sont avantageuses car l’intensité mesurée est fonction du temps, de l’échelle de longueur et du contraste SLD. En tant que telles, les expériences TR-SANS peuvent être conçues pour sonder les changements dépendants du temps dans les distributions spatiales et les compositions des échantillons. Ces avantages uniques de SANS ont conduit à des informations importantes sur les processus cinétiques dans de nombreux systèmes de matériaux mous tels que les tensioactifs 36,37,38, les émulsions 39,40,41, les lipides 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ^,50, et polymères 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. La plupart des études TR-SANS se sont concentrées sur des échelles de temps allant de quelques minutes à quelques heures. Cependant, de nombreux processus cinétiques d’intérêt se produisent sur la deuxième échelle de temps et sont essentiels pour comprendre les mécanismes sous-jacents. La capture de ces premiers points temporels nécessite que les solutions soient rapidement mélangées et mesurées in situ, dans lesquelles le mélange est synchronisé avec la collecte de données pendant la diffusion de la lumière à écoulement arrêté 27,28,29,30,31,32, la fluorescence 22,23,24,25,26 et les rayons X 16,17,18,19,20,21 expériences. Ce travail décrit l’utilisation d’un environnement d’échantillonnage conçu pour mélanger rapidement plusieurs échantillons liquides et injecter le mélange dans une cellule en verre de quartz pour les mesures TR-SANS. Le dispositif de mélange est une adaptation du dispositif rheoSANS capillaire^{récemment développé 63} et utilise plusieurs pompes à seringue et vannes pour contrôler le mélange des échantillons et automatiser le nettoyage des cellules. En connectant les pompes à seringue à une série de vannes sélecteur de débit, plusieurs flux d’entrée peuvent être mélangés, mesurés, rincés et séchés à plusieurs reprises pour faciliter les mesures TR-SANS sur l’échelle de temps des secondes.

La procédure actuelle suppose que les échantillons d’intérêt ont été identifiés et préparés. Nous nous concentrons sur la configuration du mélange in situ et les méthodes de collecte des données TR-SANS. Les données de diffusion neutronique ont été recueillies sur l’instrument VSANS au NIST Center for Neutron Research (NCNR); toutefois, la procédure devrait être applicable à d’autres instruments SANS. Les lecteurs intéressés à mettre en œuvre des protocoles similaires sur d’autres instruments SANS devraient consulter les scientifiques locaux afin de déterminer la configuration optimale de l’instrument pour maximiser le flux de neutrons à l’échelle de longueur et à l’échelle de temps souhaitées les plus pertinentes pour les processus cinétiques d’intérêt. Les données présentées ici ont été recueillies à l’aide de la configuration à « faisceau blanc » à haut flux sur VSANS afin de maximiser le nombre de neutrons à la perte de résolution spatiale⁵. Les chariots du détecteur ont été positionnés de manière à couvrir une gamme de vecteurs de diffusion (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 ^Å-1, correspondant à des échelles de longueur de ≈130 nm à ≈13 nm. Le vecteur de diffusion est défini comme q = 4π/λ sin (θ/2) dans lequel λ est la longueur d’onde des neutrons et θ est l’angle de diffusion.

Le dispositif de mélange à écoulement arrêté utilisé pour les mesures TR-SANS se compose de plusieurs pompes, de seringues de rinçage, de seringues d’échantillon, de sélecteurs de débit, ainsi que d’un mélangeur adynamique, d’une cellule d’échantillonnage et d’un récipient d’échantillon mixte, comme illustré à la figure 1. Tous les chemins de fluide scellés sont situés à l’intérieur d’une enceinte climatisée, qui comprend les seringues, les valves, les tubes de connexion, le mélangeur dynamique et les cellules d’échantillonnage. Un climatiseur thermoélectrique programmable est utilisé pour contrôler la température de l’enceinte dans la plage de 10 °C à 50 °C dans les ±1 °C. Notez qu’une partie de l’isolant du boîtier a été retirée pour montrer les parties fonctionnelles de l’appareil. L’enceinte principale du dispositif de mélange est positionnée sur une platine translationnelle sur la ligne de faisceau NG3 VSANS au NCNR. La position de l’enceinte est ajustée à l’aide de l’étage de translation pour positionner la cellule d’échantillon sur le trajet du faisceau de neutrons (ligne pointillée jaune).

Figure 1 : Exemple de configuration pour combiner le mélange à flux arrêté et les mesures de diffusion de neutrons aux petits angles à la ligne de faisceau VSANS du Centre de recherche sur les neutrons du NIST. L’installation contient quatre pompes à seringues, deux seringues pour le rinçage des solvants et deux seringues pour l’injection d’échantillons, quatre vannes sélecteur de pompe, deux vannes sélecteur de mélangeur, un mélangeur dynamique, une cellule de quartz à écoulement continu et un récipient d’échantillon mixte. Les neutrons incidents dispersent l’échantillon mélangé situé à l’intérieur de la cellule d’échantillon. Une enceinte isolée avec des fenêtres en quartz et une unité thermoélectrique climatisée est utilisée pour contrôler l’échantillon et tous les équipements à température constante. La ligne pointillée jaune montre le trajet du faisceau de neutrons. Barre d’échelle = 10 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le dispositif illustré à la figure 1 est configuré avec deux seringues d’échantillon, deux seringues de rinçage et une cellule d’échantillonnage. Les organigrammes correspondants pour les différentes étapes du protocole sont illustrés à la figure 2. Les volumes souhaités des deux échantillons différents sont injectés dans le mélangeur et la cellule d’échantillonnage (Figure 2A). Une fois la cellule d’échantillon remplie, la vanne d’admission (ISV) et la vanne de commutation de sortie (OSV) sont fermées pour isoler la cellule d’échantillon du mélangeur dynamique et empêcher la rediffusion de l’échantillon dans la cellule pendant la collecte de données TR-SANS (Figure 2B). Avant le mélangeur dynamique, la longueur du tube de raccordement varie de 10 cm à 1 m et n’affecte pas le temps de temps de mélange. Cependant, les connexions de tubes entre le mélangeur dynamique et la cellule d’échantillon affecteront le temps de retard de mélange et le volume d’injection d’échantillon requis. Des tubes en acier inoxydable prédécoupés de 0,04 pouce (1 mm) de diamètre intérieur et de 100 mm de longueur sont utilisés pour connecter le mélangeur dynamique, les vannes sélecteur de mélangeur (MSV1 et MSV2), ainsi que les ISV et OSV. Un tube fluoré de 1 mm de diamètre intérieur et de 115 mm de longueur est utilisé pour connecter l’ISV et l’OSV (ou la sortie du mélangeur dynamique) à la cellule d’échantillonnage. Le volume total de vide qui influence le temps de délai de mélange comprend le volume de vide du mélangeur (0,15 mL), le tube entre la sortie du mélangeur et l’entrée de la cellule d’échantillon (0,09 mL) et le volume de la cellule échantillon (0,16 mL). Dans cet exemple, le volume total du vide est de 0,4 mL. Les volumes de vide interne des vannes sont négligeables par rapport aux volumes de vide des tubes, du mélangeur et de la cellule d’échantillonnage. Par exemple, les vannes sélecteur basse pression utilisées (diamètre d’alésage de 0,75 mm) contiennent des volumes de vide approximatifs de 4 μL, tandis que les vannes sélecteur haute pression et les vannes de commutation (diamètre d’alésage de 0,25 mm) contiennent des volumes de vide approximatifs de 0,5 μL.

Une fois la mesure TR-SANS terminée, l’échantillon est expulsé de la cellule avec un solvant, et le solvant de rinçage est pompé à plusieurs reprises à travers la cellule pour éliminer l’échantillon résiduel et nettoyer la cellule d’échantillon (Figure 2C). Notez que les seringues de rinçage sont connectées à des réservoirs de solvant plus grands (p. ex. eau et éthanol) au moyen de valeurs de sélecteur de pompe pour s’assurer que des volumes de solvant adéquats sont disponibles pour nettoyer la cellule d’échantillon entre les cycles de mesure. Les sources de solvants, les sources d’échantillons et les contenants d’échantillons mélangés contenant des liquides inflammables sont placés dans une enceinte séparée sans équipement électrique pour éliminer toutes les sources d’inflammation possibles. De plus, des bouchons de bouteilles à verrouillage de la vapeur sont utilisés pour minimiser les vapeurs inflammables et l’évaporation des solvants. Enfin, la cellule d’échantillon est séchée avec un flux d’azote gazeux pour éliminer le solvant de rinçage résiduel (figure 2D). La pression d’azote gazeux à l’entrée de la vanne sélecteur du mélangeur est réglée à environ 2 bar (0,2 MPa, pression manométrique) à l’aide d’un régulateur de pression manuel situé sur la bouteille d’azote gazeux. Une fois que la cellule d’échantillon est suffisamment nettoyée et séchée, un échantillon nouvellement mélangé est injecté dans la cellule d’échantillon pour le cycle de mesure suivant (en répétant le mélange et l’injection illustrés dans le diagramme de flux de la figure 2A).

Figure 2 : Exemple d’organigramme utilisant une cellule d’échantillonnage, deux échantillons mélangés et deux solvants de rinçage pour le nettoyage. (A) Mélange de l’échantillon A (bleu) et de l’échantillon B (rouge), puis écoulement de l’échantillon mélangé (violet) dans la cellule d’échantillon. (B) Pendant la collecte des données, l’état du dispositif d’écoulement arrêté où les vannes de commutation ISV et OSV sont fermées pour isoler la cellule d’échantillonnage et empêcher la rétrodiffusion de l’échantillon pendant la collecte des données. (C) Les étapes de nettoyage où la cellule d’échantillon est rincée avec le solvant de rinçage de SS1 (vert) après la collecte des données. D) Étape de séchage au cours de laquelle la cellule d’échantillonnage est séchée à l’azote gazeux (orange). Abréviations : PSV = robinet sélecteur de pompe; MSV = vanne sélecteur de mélangeur; OSV = vanne de commutation de sortie; ISV = vanne d’interrupteur d’admission; SS1 = source de solvant 1; ASS = source d’échantillon A; N2 = source d’azote gazeux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 3 montre des organigrammes pour une version légèrement différente dans laquelle la configuration de mélange est configurée avec deux cellules d’échantillonnage distinctes connectées aux mêmes vannes de commutation (figure 3A). Alors que les données TR-SANS sont recueillies dans la cellule d’échantillon 1, la cellule d’échantillon 2 est rincée (figure 3B) et séchée (figure 3C). Lorsque la collecte de données est terminée pour la cellule d’échantillon 1, la vanne d’interrupteur d’admission dirige un échantillon nouvellement mélangé dans la cellule d’échantillon 2 pour la collecte de données (figure 3D). Alors que les données TR-SANS sont recueillies dans la cellule d’échantillon 2, la cellule d’échantillon 1 est rincée et séchée (figure 3E). Ce processus parallèle alterné entre deux cellules d’échantillon minimise le temps entre les injections ultérieures d’échantillons et maximise l’utilisation du temps de faisceau de neutrons.

Figure 3 : Exemple d’organigramme utilisant deux cellules d’échantillonnage, deux échantillons mélangés et deux solvants de rinçage pour le nettoyage. (A) Mélanger l’échantillon A (bleu) et l’échantillon B (rouge), puis faire couler l’échantillon mélangé (violet) dans la cellule d’échantillon 1. (B) L’état du dispositif d’écoulement arrêté pendant la collecte des données sur la cellule d’échantillon 1 pendant que la cellule d’échantillon 2 est rincée avec le solvant de SS1 (vert). (C) L’état du dispositif d’écoulement arrêté pendant la collecte des données sur la cellule d’échantillonnage 1 pendant que la cellule d’échantillon 2 est séchée avec de l’azote gazeux (orange). (D) Une fois la collecte des données de la cellule d’échantillon 1 terminée, un nouvel échantillon (violet) est immédiatement mélangé et acheminé dans la cellule d’échantillon 2. E) L’état du dispositif d’écoulement arrêté pendant la collecte des données sur la cellule d’échantillonnage 2 pendant que la cellule d’échantillon 1 est rincée avec le solvant de SS1 (vert). Pendant qu’une cellule d’échantillon est mesurée, l’autre cellule d’échantillon est nettoyée et séchée. Le processus de mesure du débit arrêté alterne entre deux cellules d’échantillonnage afin de minimiser le temps entre les injections ultérieures de mélange d’échantillons. Abréviations : PSV = robinet sélecteur de pompe; MSV = vanne sélecteur de mélangeur; OSV = vanne de commutation de sortie; ISV = vanne d’interrupteur d’admission; SS1 = source de solvant 1; ASS = source d’échantillon A; N2 = source d’azote gazeux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Un protocole étape par étape est décrit ci-dessous pour connecter les pompes et les conduites de tuyauterie, amorcer le système, rincer et sécher la cellule d’échantillon et injecter l’échantillon mélangé. Bien que la simplicité de la configuration à cellule unique soit démontrée (Figure 2), la configuration modulaire flexible, le protocole et les scripts peuvent être facilement modifiés pour implémenter davantage de pompes à seringues, de vannes, de mélangeurs ou de configurations de cellules d’échantillonnage, telles que la configuration à deux cellules à échantillon illustrée à la Figure 3. Les données représentatives du taux brut de numération des neutrons recueillies tout au long des cycles d’injection de mélange et de nettoyage sont présentées à la figure 4, tandis que la cinétique d’échange lipidique mesurée à 3 températures différentes et l’intensité diffusée normalisée extraite correspondant à la fraction de lipides échangés sont montrées à la figure 5 et à la figure 6, respectivement.