تكييف الجهاز الهضمي للعدوى المسببة للأمراض وتسلسل الخلايا المفردة تحت ظروف السلامة البيولوجية المستوى 3 (BSL-3)
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إصابة الأعضاء المعوية البشرية من جانبها apical أو basolateral لتوصيف التفاعلات المضيف / الممرض على مستوى الخلية الواحدة باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq).
Abstract
الأجهزة المعوية البشرية تشكل أفضل نموذج الخلوية لدراسة العدوى المسببة للأمراض في الجهاز الهضمي. يمكن اشتقاق هذه الأجهزة العضوية من جميع أقسام الجهاز الهضمي (المعدة ، جيجونوم ، الاثني عشر ، الايليوم ، القولون ، المستقيم) ، وعند التمايز ، تحتوي على معظم أنواع الخلايا الموجودة بشكل طبيعي في كل قسم على حدة. على سبيل المثال، تحتوي الأجهزة العضوية المعوية على خلايا إدخالية تمتص المغذيات، وخلايا إفرازية (غوبلت، بانيث، وأمعاء الغدد الصماء)، والخلايا الجذعية، وكذلك جميع وسيطات التمايز الخاصة بالنسب (على سبيل المثال، أنواع الخلايا المبكرة أو غير الناضجة). أكبر ميزة في استخدام الأجهزة العضوية المشتقة من الجهاز الهضمي لدراسة الأمراض المعدية هي إمكانية تحديد نوع الخلية المستهدفة بدقة من قبل الممرض المعوي ومعالجة ما إذا كانت الأقسام المختلفة من الجهاز الهضمي وأنواع خلاياها المحددة تستجيب بالمثل لتحديات مسببات الأمراض. على مدى السنوات الماضية، تم استخدام نماذج الجهاز الهضمي، فضلا عن organoids من الأنسجة الأخرى، لدراسة التروبليسم الفيروسي وآليات الإمراض. ومع ذلك، فإن استخدام جميع مزايا استخدام الأجهزة العضوية عند استخدام الفيروسات شديدة الإمراض يمثل تحديا تقنيا ويتطلب اعتبارات صارمة للسلامة البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، حيث غالبا ما تزرع الأعضاء في ثلاثة أبعاد ، فإن الجانب القاعدي من الخلايا يواجه الجزء الخارجي من الجهازي بينما يواجه جانبهم القردي الداخل (التجويف) للأعضاء. تشكل هذه المنظمة تحديا لمسببات الأمراض المعوية حيث يبدأ العديد من العدوى المعوية من الجانب apical / luminal من الخلايا بعد الابتلاع. ستقدم المخطوطة التالية بروتوكولا شاملا لإعداد الأعضاء المعوية البشرية للعدوى بمسببات الأمراض المعوية من خلال النظر في جانب العدوى (apical مقابل basolateral) لإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتوصيف التفاعلات المضيفة / الممرضة الخاصة بنوع الخلية. هذه الطريقة تفاصيل إعداد organoids فضلا عن الاعتبارات اللازمة لأداء هذا العمل في إطار مستوى السلامة البيولوجية 3 (BSL-3) ظروف الاحتواء.
Introduction
دراسة الروبيزم نوع الخلية الخاصة والاستجابة المناعية نوع الخلية محددة للفيروسات المعوية البشرية كانت صعبة تاريخيا بسبب عدم وجود نماذج الخلوية البشرية الأولية. وقد تم الآن القضاء على هذا القيد جزئيا مع تطوير organoids1. في حالة الجهاز الهضمي ، تم تطوير نماذج المعدة والجهاز العضوي المعوي للبشر والعديد من الأنواع الأخرى (على سبيل المثال ، مورين، البقرة ، القطط ، الخفافيش)2،3،4،5،6. الأجهزة المعوية استنساخ الهندسة المعمارية الهيكلية للظهارة المعوية البشرية وتحتوي على هياكل سرداب وزغب مثل، الأنساب المعوية وظيفية، وحتى تم استخدامها لتحديد أنساب الخلايا غير معروفة سابقا. يمكن استخدام نهجين مختلفين لزراعة الأجهزة العضوية المعوية. أولا، يتم عزل الخلايا الجذعية المعوية التي تحتوي على سرداب من استئصال الأنسجة أو الخزعات وتزرع في ظل ظروف ثقافية محددة (على سبيل المثال، Wnt3A، R-spondin، Noggin، وEGF) لتوسيع، ومن ثم التفريق بين الخلايا الجذعية لمعظم أنساب الخلايا المعوية (على سبيلالمثال، enterocytes، خلايا بانيث، خلايا غوبلت، خلايا الأمعاء)7. تسمح هذه الطريقة بعزل الأعضاء العضوية عن جميع أقسام الجهاز الهضمي(علىسبيل المثال ، المعدة ، الاثني عشر ، جيجونوم ، الإيليوم ، والقولون). تعتمد الطريقة الثانية على الخلايا الجذعية متعددة القدرات أو الجنينية التي يسببها الإنسان ، والتي يتم تمييزها بعد ذلك في عملية تدريجية إلى خلايا ظهارية معوية8. غالبا ما توصف هذه الأجهزة العضوية المستحثة القائمة على الخلايا الجذعية بأنها ذات طبيعة جنينية أكثر مقارنة بالأعضاء المشتقة من المريض. في حين أن جميع هذه النماذج العضوية كانت حاسمة لكشف الإشارات التنموية اللازمة لتشكيل الجهاز المعوي ، فإن استخدامها في أبحاث الأمراض المعدية لا يزال في مهده.
الفيروس المعوي هو مصطلح واسع يغطي جميع الفيروسات ، والتي تصيب من خلال الجهاز الهضمي ، مثل فيروسات picorna(علىسبيل المثال ، EV – 71) ، الفيروسات الروفيروس (على سبيل المثال ، فيروس الروتا) ، والفيروسات الكلوية (على سبيل المثال ، نوروفيروس)9. تبدأ الفيروسات المعوية دورة حياتها المعدية من خلال تناول الطعام والماء الملوثين ، مما يجعل الناس في البلدان النامية معرضين لخطر كبير بسبب تصريف النفايات غير المعالجة في البيئة ونقص الرعاية الطبية بعد ظهور العدوى10. اعتمادا على نوع الممرض ، يمكن أن تؤدي العدوى إلى التهاب المعدة والأمعاء والقيء و / أو الإسهال المائي بسبب تسرب بطانة الأمعاء. الفيروسات النوروية البشرية هي مسببات الأمراض المعوية المنتشرة للغاية والمعدية للغاية ، التي تؤدي إلى أكثر من 600 مليون عدوى و 15 مليون دخول المستشفى في جميع أنحاء العالم11. وقد Organoids مفتاح البحوث نوروفيروس لأنها تدعم العدوى وتكرار نوروفيروس الإنسان، الذي كان سابقا غير قادر على أن تكون مثقفة في نماذج ثقافة الخلايا القياسية12.
على مدى العقدين الماضيين ، ظهرت الفيروسات التاجية كمسببات أمراض بشرية رئيسية13. وتشمل هذه الأسرة فيروس كورونا المسبب للأمراض الشديد، والسارس-CoV-1، والسارس-CoV-2، والتي تتطلب احتواء صارم على مستوى السلامة عند إجراء البحوث على هذه الفيروسات. ومن المثير للاهتمام، في حين أن جميع هذه مسببات الأمراض الثلاثة معترف بها في الغالب لأعراضها التنفسية المستحثة وضيقها، فمن الواضح الآن أن هذه الفيروسات لا تصيب الجهاز التنفسي فقط ولكن أيضا الأعضاء الأخرى. علم أمراض مهم الناجمة عن مرض سارس-CoV-2 المرضى المصابين إلى جانب الضائقة التنفسية هو وجود أعراض الجهاز الهضمي14. يظهر على جزء صغير من المرضى المصابين بالسارس- كو فى-2 مثل هذه الأعراض، تتراوح بين الإسهال الخفيف جدا والإسهال الشديد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الكشف عن جينوم سارس-CoV-2 في خزعات البراز والجهاز الهضمي للمرضى المصابين15. ومن المهم ان وجود اعراض الجهاز المعوى لا يقتصر على السارس – فيروس كورونا – 2 كما لوحظ ايضا فى مرضى فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الاوسط التنفسية والسارس – فيروس الكوافير – 1 . لفهم كيف يسبب السارس-CoV-2 الضيق المعدي المعوي وتحديد بالضبط تروبية السارس-CoV-2 في الجهاز الهضمي، كانت الأجهزة المعوية البشرية أداة رئيسية ويتم استغلالها الآن لكشف الاستجابات الخاصة بنوع الخلية لهذا الممرض16،17.
التنميط النسخي لأعضاء الخلية (تسلسل الحمض النووي الريبي السائب) كان ممارسة معتادة عند تقييم العدوى المسببة للأمراض في كل من خطوط الخلايا الخالدة وكذلك مع الأجهزة العضوية. في حين أن هذا يسمح لنا بتحديد التغيرات العالمية استجابة لمسببات الأمراض (على سبيل المثال، رفع تنظيم السيتوكينات)، فإن الرناسيك السائب لا يسمح لنا بتحديد سبب كون خلايا محددة في السكان أكثر عرضة للعدوى من غيرها. أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) أداة قوية لكشف برامج النسخ الخاصة بالنسب الخلوي ويمكن استخدامه لتحديد كيفية دعم هذه البرامج أو قمع عدوى الفيروس18،19. وكان أول وصف scRNAseq في عام 2009 ، وكان يستخدم لتقييم ملامح النسخ من الخلايا المختلفة الموجودة في blastomere الماوس20. وقد تم الآن توسيع نطاق هذه التكنولوجيات ويمكن تنفيذها من خلال عدة منصات مختلفة. الإصدارات المبكرة من هذه التكنولوجيا تطبيق مضان تنشيط فرز الخلايا (FACS) لفصل الخلايا الفردية للتسلسل، والتي كانت تقتصر في كثير من الأحيان على لوحات 96-أو 384-جيدا، وبالتالي إعطاء 300 خلايا فردية لتحليل لكل عينة21. وقد تم الآن تطوير هذه الأساليب من خلال منصات تسلسل الخلية الواحدة ، والتي تستخدم جهاز microfluidic لتغليف خلايا واحدة في قطرات فردية مع الباركود الذي يحتوي على الخرز. تسمح هذه التقنية بالتقاط ما يصل إلى 10,000 خلية لكل حالة عينة.
الجمع بين تكنولوجيا organoids مع scRNAseq يسمح لنا لدراسة كيفية تأثير مسببات الأمراض المعوية في الجهاز الهضمي بطريقة محددة نوع الخلية. ومع ذلك، يلزم أخذ عدة اعتبارات تقنية واعتبارات السلامة الأحيائية. أولا وقبل كل شيء، أساليب ثقافة organoids الكلاسيكية (3 الأبعاد (3D) organoids، جزءا لا يتجزأ من مصفوفة خارج الخلية (ECM)) فضح الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية إلى خارج الجهاز. كما مسببات الأمراض المعوية بدء العدوى من خلال ابتلاع الطعام الملوث / الماء، والعدوى في معظم الأحيان يبدأ من الجانب apical من الخلايا، والتي لا يمكن الوصول إليها في هذه organoids المعوية 3D. لذلك ، يجب أن تكون الأعضاء مستعدة لجعل الجانب apical متاحا للعدوى الممرضة إما عن طريق البذر ثلاثي الأبعاد ، وبالتالي تعريض الجانب apical للخلايا مباشرة ، أو من خلال التجميل الدقيق22،23. ثانيا، لإجراء scRNAseq من العينات البيولوجية المصابة، من المهم النظر في طبيعتها المعدية. في حين تم اقتراح طرق لإصلاح الخلايا وتعطيل مسببات الأمراض قبل عزل خلية واحدة لRNAseq اللاحقة، وهذه الأساليب غالبا ما تؤدي إلى انخفاض في نوعية التسلسل18. يصف البروتوكول أدناه عدة طرق لإصابة الأعضاء المعوية بالفيروسات المعوية بالنظر إلى جانب العدوى (العدوى القاعدية مقابل القاعدية)(الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، سيتضمن البروتوكول سير عمل لفصل وعزل الخلايا المفردة عن الأعضاء المصابة بالفيروسات شديدة الإمراض ل scRNAseq. وسيسلط البروتوكول الضوء على الخطوات الرئيسية التي يتعين تنفيذها عند العمل في ظل ظروف احتواء السلامة الأحيائية من المستوى 3 (BSL-3) لتجنب توليد الهباء الجوي والتلوث المحتمل.
Protocol
Representative Results
Discussion
مسببات الأمراض المعوية في معظم الأحيان بدء دورة حياتها عن طريق إصابة الخلايا الظهارية المعوية من جانبها apical التي تواجه تجويف الأمعاء. في حين أن الأجهزة العضوية معترف بها جيدا لتكون نموذجا جيدا لإعادة إنتاج التعقيد الخلوي وتنظيم الظهارة المعوية ، فإن تنظيمها كهياكل ثلاثية الأبعاد ومغلقة تجعل غشاءها apical غير قابل للوصول إلى الممرض. وصف هذا البروتوكول طرق إصابة الأجهزة العضوية المعوية من جانبها القردي ، أو جانبها القاعدي ، أو كليهما بمسببات الأمراض BLS-3. يمكن بسهولة تكييف هذه البروتوكولات لدراسة أي مسببات أمراض دخولية تحت احتواء BSL-2 أو BLS-3 أو أي نموذج عضوي آخر باتباع بعض الخطوات الحرجة التي يتم تسليط الضوء عليها أدناه. الطريقة المذكورة أعلاه هي لعزل وإعداد قطرات أحادية الخلية وفقا للوائح في ألمانيا. 10- وإخلاء المسؤولية، لا يصف هذا البروتوكول تدابير معالجة السلامة الأحيائية (إجراءات التشغيل الموحدة) التي يلزم اتخاذها أثناء العمل في إطار شروط BSL-3. ومن المهم أيضا الإصرار على أن اللوائح قد تختلف في بلدان أخرى وأنه يجب الاتصال بالسلطات المحلية للتأكد من احترام جميع اللوائح المحلية.
واحدة من الخطوات الحاسمة في بذر organoids في بعدين للعدوى apical هو السيطرة على أن الخلايا سوف تفرق بالمثل بالمقارنة مع عندما تزرع كما organoids ثلاثية الأبعاد الكلاسيكية. اعتمادا على الممرض المعوي ، يمكن أن يقتصر التروبزم على خلايا نادرة جدا أو على الخلايا التي تحتاج إلى تمييز كبير. في هذه الحالة ، يمكن أن يؤدي استخدام عضو ثنائي الأبعاد لم يفرق تماما إلى سوء الدمج بأن هذا الممرض المعوي لا يمكن أن يصيب الأعضاء المعوية. ويقترح، إن أمكن، إجراء العدوى باستخدام التكوينات الثلاثة لهذا البروتوكول: 2D organoid للعدوى apical فقط (القسم 2)، متصدع الأجهزة العضوية 3D مفتوحة للعدوى apical وbasolateral (القسم 3)، والأعضاء 3D الكامل للعدوى القاعدية فقط (القسم 3). وسيساعد هذا النهج على تمييز مسار دخول العامل الممرض (apical vs. basolateral) وسيتحكم أيضا في تحقيق مستوى مماثل من التمايز. البديل للعدوى 2D apical هو microinjection ، والتي سوف تستخدم 3D organoid ولكن تسليم الممرض مباشرة إلى الجانب apical (انظر بارتفيلد وآخرون27 للحصول على تفاصيل). تتطلب هذه الطريقة حاقن ماهر لضمان وضع الممرض بشكل صحيح ، وتظل الأعضاء العضوية سليمة. يستخدم الميكروينيكشن عادة في احتواء BSL-2 وقد لا يكون مناسبا لاحتواء BSL-3.
وهناك اعتبار مهم إضافي عند إجراء تجارب العدوى في الأجهزة العضوية ذات البذور 2D هو كثافة الخلية النهائية. كما ذكر في الخطوة 2.3، سيتم بذر 100-150 organoids في بئر واحد من لوحة 48 جيدا أو بئر واحد من شريحة غرفة زجاجية القاع 8 جيدا. اعتمادا على خط organoid وعلى الشخص الذي يتعامل مع organoids ، يمكن أن يكون حجم هذه organoids مختلفة بشكل كبير. وهذا يمكن أن يؤدي إلى كثافات خلايا مختلفة جدا في لوحة 48 جيدا أو 8-جيدا الزجاج القاع الشريحة الغرفة. اعتمادا على الفيروس المعوي، تفضل بعض الفيروسات خلايا أكثر متناثرة، في حين أن البعض الآخر سوف تكون أيضا قادرة على إصابة الخلايا التقاء. الأصل الجزيئي لمثل هذه الاختلافات في العدوى لالتقاء الخلايا المختلفة غير واضح. ولذلك، ينبغي إجراء تجارب تجريبية تهدف إلى إيجاد أفضل كثافة خلايا لمسبب الأمراض المعوي الذي يختاره قبل إجراء المزيد من التوصيف في المصب.
غالبا ما يتم إجراء فرز FACS قبل إجراء مستحلب قطرة الخلية الواحدة. وغالبا ما تستخدم هذه الخطوة لفصل الميت من الخلايا الحية والخلايا المفردة من doublets. عند العمل مع مسببات الأمراض BSL-3 ، فإنه يتطلب أن يكون المرفق مجهزا بفرز FACS مناسب ، وهو ما لا يحدث في كثير من الأحيان. علاوة على ذلك ، ليس كل الخلايا في الجهاز بنفس الحجم ، وغالبا ما يكون من الصعب التمييز بين مزدوج أو خلية أكبر ، مما يسبب خطر الاختيار السلبي ضد نوع خلية محددة. كما لا تزال هناك مناقشة في الميدان حول ما إذا كان الوقت اللازم لفرز ما بين 5000-10000 لكل عينة يمكن أن يؤدي إلى تعديل كبير في ملف تعريف النص للخلايا الفردية. في حين تم وصف طرق تثبيت الخلية المتوافقة مع تسلسل الخلية الواحدة (على سبيل المثال ، الميثانول وRNAassist) ، لوحظ أن هذا يؤدي إلى انخفاض في جودة التسلسل18. وأخيرا، يشتبه في أن فرز الخلايا باستخدام علامات موت الخلية يمكن أن يؤدي أيضا إلى التحيز. وبالنظر إلى الانتشار الاتجاهي والتمايز للخلايا من خلال محور سرداب زغب، وتقع الخلايا الأكثر تميزا، والتي سوف يتم تسليطها والإفراج عنها، في غيض من الزغب. غالبا ما تكون هذه الخلايا إيجابية بالنسبة للعلامات المختلفة لمسارات موت الخلايا(مثل موت الخلايا المبرمج والنخر والنخر)؛ ومع ذلك ، عند النظر إلى عدوى فيروس الروتا في أمعاء الماوس ، فإن طرف الزغب هو المنطقة الأكثرإصابة 28. وبالتالي، فإن تصفية الخلايا التي قد تبدو إيجابية لعلامات الموت سيؤدي إلى اختيار سلبي للخلايا المصابة التي قد تمثل العدوى الفسيولوجية. حاليا، لا يوجد حل جيد لفرز وإصلاح organoids قبل تسلسل خلية واحدة. يوصى باستخدام الخلايا الحية غير المفتورة حيث يلزم إجراء مزيد من الدراسات للعثور على بروتوكولات بديلة مناسبة.
أحدث تسلسل الخلية الواحدة ثورة في كيفية تقييم الاستجابات الخلوية. تسمح هذه التقنية بتحديد الاستجابات الخاصة بخلايا النسب سواء في الحالات القاعدية أو في حالات العدوى المسببة للأمراض. فتحت هذه الطريقة الأبواب في العديد من الحقول التي كانت محدودة سابقا بواسطة قراءات مجمعة. في حين أن هذا الأسلوب هو قوي جدا، لديها حدودها. ويتمثل أحد القيود الرئيسية في التحليل المعلوماتي الحيوي الشامل المطلوب في المصب للتسلسل. هذا هو المفتاح خاصة عند تحليل الأنسجة وتعيين أنواع الخلايا حيث لا يوجد حاليا أي تعليق توضيحي. وجود المعلوماتية الحيوية المهرة مطلوب لدعم جميع الدراسات وحيدة الخلية.
يصف هذا البروتوكول كيفية زرع ومعالجة الأجهزة العضوية المعوية البشرية ، وتصيبها بمسببات الأمراض المعوية ، وأداء scRNAseq. أصبح تكييف هذا النهج مع الأعضاء الأخرى ممكنا الآن ، حيث تم تطوير أنظمة نموذجية عضوية لمعظم الأعضاء. وبالمثل يتم تنظيم أعضاء الرئة والكبد مقارنة بالأعضاء المعوية ، وعلى هذا النحو ، يمكن نقل استخدام نهج مماثل إلى هذه الأعضاء العضوية. وسوف تكون السيطرة الحاسمة للتحقق من أنه عندما نمت في بعدين أو متصدع مفتوحة، وهذه organoids تحقيق تمايز مماثل لنظرائهم organoid 3D. السمات والجينات المحددة التي تحدد حالة متمايزة محددة لكل نموذج عضو. نماذج عضوية أخرى مثل أعضاء الكلى والأوعية الدموية ، والهياكل الكثيفة الكبيرة ، ستحتاج إلى طرق إضافية لتفكيك هذه الهياكل بشكل متسلسل إلى خلايا واحدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ميغان ستانيفر وستيف بولانت تم دعمهما بمنح بحثية من دويتشه فورشونجسجيمينشافت (DFG): (رقم المشروع 240245660، 278001972 415089553 272983813 إلى ستيف بولانت 416072091 إلى ميغان ستانيفر) وولاية بادن فورتمبرغ والبوندسمينستيريوم فور بيلونغ أوند فورشونغ BMBF 01KI20239B إلى MS و01KI20198A و (NUM-COVID 19، تم إنشاء الأورجانو سترات 01KX2021) إلى المخططات SB. في BioRender.
Materials
| Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
| 24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
| 8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
| A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
| B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
| CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
| CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
| DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
| Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
| Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
| GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
| HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
| L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
| MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
| MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
| MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
| OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
| OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
| Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
| Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
| Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
| SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
| SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
| TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
| Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |
References
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection. Cells. 9, (2020).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. Human norovirus transmission and evolution in a changing world. Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).
- Leshem, E., et al. Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, 155-160 (2016).
- Karst, S. M. The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353, 1387-1393 (2016).
- de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).
- Scaldaferri, F., et al. The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications. Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).
- Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test. Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369, 50-54 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells. Cell Reports. 32, 107863 (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. bioRxiv. , (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Molecular Systems Biology. 17, 10232 (2021).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).
- García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection. Viruses. 12, 1288 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells. Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).
- Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478 (2019).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483 (2015).
- Fujii, M., et al. Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359 (2015).
- Hernandez, P. P., et al. Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection. Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).
