Lysindusert GFP-uttrykk i sebrafiskembryoer ved hjelp av Optogenetic TAEL/C120-systemet
Summary
Optogenetikk er et kraftig verktøy med omfattende applikasjoner. Denne protokollen viser hvordan man oppnår lys-induserbart genuttrykk i sebrafiskembryoer ved hjelp av det blå lysresponsive TAEL/C120-systemet.
Abstract
Inducible genuttrykkssystemer er et uvurderlig verktøy for å studere biologiske prosesser. Optogenetiske uttrykkssystemer kan gi presis kontroll over genuttrykkstid, plassering og amplitude ved hjelp av lys som induserende middel. I denne protokollen brukes et optogenetisk uttrykkssystem for å oppnå lys-inducible genuttrykk i sebrafiskembryoer. Dette systemet er avhengig av en konstruert transkripsjonsfaktor kalt TAEL basert på en naturlig forekommende lysaktivert transkripsjonsfaktor fra bakterien E. litoralis. Når den belyses med blått lys, dimmerer TAEL, binder seg til sitt konjakkregulatoriske element kalt C120, og aktiverer transkripsjon. Denne protokollen bruker transgene sebrafiskembryoer som uttrykker TAEL-transkripsjonsfaktoren under kontroll av den allestedsnærværende ubb-promotoren. Samtidig driver C120 regulatorisk element uttrykket av et fluorescerende reportergen (GFP). Ved hjelp av et enkelt LED-panel for å levere aktiverende blått lys, kan induksjon av GFP-uttrykk først oppdages etter 30 min belysning og når en topp på mer enn 130 ganger induksjon etter 3 timers lysbehandling. Uttrykksinduksjon kan vurderes ved kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) og ved fluorescensmikroskopi. Denne metoden er en allsidig og brukervennlig tilnærming for optogenetisk genuttrykk.
Introduction
Inducible genuttrykkssystemer bidrar til å kontrollere mengden, timingen og plasseringen av genuttrykk. Det har imidlertid vært utfordrende å oppnå nøyaktig romlig og tidsmessig kontroll i multicellulære organismer. Temporal kontroll oppnås oftest ved å legge til småmolekylforbindelser1 eller aktivering av varmesjokkpromotorer2. Likevel er begge tilnærmingene sårbare for spørsmål om timing, induksjonsstyrke og stressrespons utenfor målet. Romlig kontroll oppnås hovedsakelig ved bruk av vevsspesifikke promotorer3, men denne tilnærmingen krever en passende promotor eller regulatorisk element, som ikke alltid er tilgjengelige, og det bidrar ikke til sub-vevsnivå induksjon.
I motsetning til slike konvensjonelle tilnærminger har lysaktiverte optogenetiske transkripsjonsaktivatorer potensialet for finere romlig og tidsmessig kontroll av genuttrykk4. Det blå lysresponsive TAEL/C120-systemet ble utviklet og optimalisert for bruk i sebrafiskembryoer5,6. Dette systemet er basert på en endogene lysaktivert transkripsjonsfaktor fra bakterien E. litoralis7,8. TAEL/C120-systemet består av en transkripsjonsaktivator kalt TAEL som inneholder et Kal-TA4-transaktiveringsdomene, et blått lysresponsivt LOV-domene (lys-oksygenspenningssensor) og et helix-turn-helix (HTH) DNA-bindende domene5. Når de belyses, gjennomgår LOV-domenene en konformasjonsendring som gjør at to TAEL-molekyler kan dimme, binde seg til en TAEL-responsiv C120-promotor og initiere transkripsjon av et nedstrøms gen av interesse5,8. TAEL/C120-systemet har rask og robust induksjon med minimal toksisitet, og det kan aktiveres av flere forskjellige lysleveringsmodaliteter. Nylig ble forbedringer av TAEL/C120-systemet gjort ved å legge til et kjernefysisk lokaliseringssignal til TAEL (TAEL-N) og ved å koble C120-forskriftselementet til en cFos basalpromotor (C120F) (figur 1A). Disse endringene forbedret induksjonsnivåene med mer enn 15 ganger6.
I denne protokollen brukes et enkelt LED-panel til å aktivere TAEL / C120-systemet og indusere det allestedsnærværende uttrykket til et reportergen, GFP. Uttrykksinduksjon kan overvåkes kvalitativt ved å observere fluorescensintensitet eller kvantitativt ved å måle transkripsjonsnivåer ved hjelp av kvantitativ sanntids-PCR (qRT-PCR). Denne protokollen vil demonstrere TAEL/C120-systemet som et allsidig, brukervennlig verktøy som muliggjør robust regulering av genuttrykk in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver bruken av optogenetisk TAEL/C120-system for å oppnå blått lys-induserbart genuttrykk. Dette systemet består av en transkripsjonsaktivator, TAEL, som dimmerer ved belysning med blått lys og aktiverer transkripsjon av et gen av interesse nedstrøms for et C120 regulatorisk element. Indusert uttrykk for en GFP-reporter kan oppdages etter så lite som 30 min lyseksponering, noe som tyder på at denne tilnærmingen har relativt rask og responsiv kinetikk.
Flere fakt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Stefan Materna og medlemmer av Woo- og Materna-laboratoriene for nyttige forslag og kommentarer til denne protokollen. Vi takker Anna Reade, Kevin Gardner og Laura Motta-Mena for verdifull diskusjon og innsikt mens vi utvikler denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) og University of California Cancer Research Coordinating Committee (CRN-20-636896) til S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. 생화학. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738 (2012).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), (2019).
