התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס
Summary
אנו מתארים טכניקת התמרה חולפת מהירה בשלבים התפתחותיים שונים של Echinococcus granulosus באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי.
Abstract
אכינוקוקוזיס ציסטי או מחלה הידאטית היא אחת המחלות הטפיליות הזואונוטיות החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה הניצבת במעי של כלבים. יש צורך דחוף במחקר גנטי יישומי כדי להבין את המנגנונים של פתוגנזה ובקרת מחלות ומניעתן. עם זאת, היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מעכב פרשנות ישירה של הגנטיקה התפקודית של טפילי צסטודה, כולל המינים Echinococcus . המחקר הנוכחי מדגים את הפוטנציאל של התמרת גנים לנטי-ויראליים חולפים בצורות המטא-אקסטודות והסטרוביליות של E. granulosus. פרוטוסקולקסים (PSCs) בודדו מציסטות הידאטידיות והועברו למדיה ספציפית של תרביות דו-פאזיות כדי להתפתח לתולעים סטרוביליות. התולעים עברו טרנספקציה עם נגיף לנטי מהדור השלישי שנקטף, יחד עם תאי HEK293T כבקרת תהליך התמרה. פלואורסצנציה בולטת זוהתה בתולעים הסטרובינציות במשך 24 שעות ו-48 שעות, מה שמעיד על התמרת לנטי-וירוס חולפת ב-E. granulosus. עבודה זו מציגה את הניסיון הראשון להתמרה חולפת מבוססת לנטי-וירוס בתולעים מדגימה את התוצאות המבטיחות עם השלכות פוטנציאליות במחקרים ניסיוניים על ביולוגיה של תולעים שטוחות.
Introduction
אכינוקוקוזיס ציסטי (CE) היא אחת ממחלות הלמינת החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה בתוך המשפחה Taeniidae 1,2. נערכו מחקרים נרחבים על פיתוח אימונו-דיאגנוסטי וחיסונים עבור E. granulosus. עם זאת, ידע לקוי על הבסיס המולקולרי של הביולוגיה של הטפילים מציב מגבלות משמעותיות באבחון, ניהול ומניעה של מחלה היידטית 3,4,5,6.
בשנים האחרונות, בשל פיתוח שיטות ריצוף גנום ותעתיק, נערכו מגוון רחב של מחקרים מולקולריים על תולעים שטוחות על ידי מספר קבוצות מחקר 7,8,9. עם זאת, בעולם הטפילים, ההתקדמות בטכנולוגיית העברת הגנים בתולעים שטוחות טפיליות עדיין מוגבלת בהשוואה לשיטות ההתמרה הארעיות הניתנות לשחזור שפותחו עבור פרוטוזואה מסוימת 10,11,12.
השימוש במערכות לידה ויראליות התגלה ככלי חיוני להעברת טרנסגנים ולחקירות גנים/חלבונים בשני העשורים האחרונים13. נגיף הלנטי מדביק גם תאים מתחלקים וגם תאים שאינם מתחלקים, ובכך מאפשר להדביק תאים פוסט-מיטוטיים 14,15,16. עדויות עדכניות מצביעות על כך ששימוש במערכת התמרה מבוססת לנטי-וירוס בתאי יונקים מציע את הפוטנציאל להתגבר על רוב המגבלות של טכניקות קודמות של דפיקה/הפלה. התכנון והבנייה של וקטורים לנטי-ויראליים של ביטוי עם סמנים מולקולריים מתאימים, כגון ביטוי GFP, תוארו בעבר16. לכן, אנו מעריכים התמרה חולפת לנטי-ויראלית של גן מדווח GFP בפרוטוסקולקסים ובתולעים הסטרובילות של E. granulosus.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבנת הבסיס המולקולרי של נמטודות וביולוגיה של פלטיהלמינתס חיונית להבנת הפתוגניות של טפילים זואונוטיים27. היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מהווה מכשול מרכזי לפרשנות ישירה של גנטיקה פונקציונלית של טפילי צסטודה, כולל מיני אכינוקוק 12,27. המחקר הנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי ועדת מענקי חוקרי העילית תחת פרס מספר 958680 מטעם המכון הלאומי לפיתוח מחקר רפואי (NIMAD), טהראן, איראן.
Materials
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
References
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55 (2016).
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161 (2015).
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230 (2011).
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A., Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
