Исследования взаимодействия шаперон-кочаперон с использованием гомогенного бисероплетения

Молекулярные шапероны способствуют гомеостазу белка, включая сворачивание белка, транспорт и деградацию. Они регулируют несколько клеточных процессов и связаны с многочисленными заболеваниями, такими как рак и нейродегенеративные заболевания^1. Белок теплового шока 90 (Hsp90) является одним из наиболее важных шаперонов, функция которого зависит от конформационных изменений, вызванных гидролизом АТФ и связыванием с клиентскими белками, опосредованными его ко-шаперонами^2. Несмотря на очевидный потенциал Hsp90 в качестве терапевтической мишени, тонкая настройка его функции представляет собой большую проблему. Существует несколько ингибиторов Hsp90, нацеленных на N-концевую область связывания АТФ, которые были оценены в клинических испытаниях, но ни один из них не был одобрен для маркетинга^3. Из-за отсутствия четко определенного лигандсвязывающего^{кармана 4,}нацеливание на С-концевую область Hsp90 имело ограниченный успех^4. В последнее время нарушение взаимодействий Hsp90-кохаперонов малыми молекулами было исследовано в качестве альтернативной стратегии^5. Нацеливание на взаимодействия Hsp90-кохаперонов не вызывает общей реакции клеточного стресса и дает возможность специфически регулировать различные внутриклеточные процессы. Законсервированный пентапептид MEEVD на С-конце Hsp90 отвечает за взаимодействие с мотивом тетратрикопептидного повтора (TPR) ко-шаперонов^6. Из 736 белков, содержащих мотивы TPR, аннотированных в базе данных белков человека, ~ 20 различных белков взаимодействуют с Hsp90 через этот^{пептид 7.} Молекулы, конкурирующие за пептидное связывание MEEVD, нарушат взаимодействие между Hsp90 и ко-шаперонами, содержащими домен TPR. Сайт связывания пептидов имеет сходную третичную структуру, но общая гомология между различными доменами мотивов TPR относительно низкая^7,что дает возможность идентифицировать молекулы, специально способные блокировать взаимодействия между Hsp90 и конкретными TPR-мотивными ко-шаперонами. Среди этих TPR-мотивных ко-шаперонов FK506-связывающий белок (FKBP) 51 и FKBP52 являются регуляторами передачи сигналов рецепторов стероидных гормонов (SHR) и участвуют в нескольких стероидных гормонозависимых заболеваниях, включая рак, связанные со стрессом заболевания, метаболические заболевания и болезнь Альцгеймера^8. Хотя FKBP51 и FKBP52 имеют > 80% сходства последовательностей, их функции различаются: FKBP52 является положительным регулятором деятельности SHR, в то время как FKBP51 является отрицательным регулятором в большинстве случаев^8. Таким образом, идентификация молекул, специфически блокирующих взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52, обеспечивает многообещающий терапевтический потенциал для связанных заболеваний.

Усыпляемый L-умингесцентный Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) был впервые разработан в 1994 году Ullman EF et al.⁹. В настоящее время он широко используется для обнаружения различных типов биологических взаимодействий, таких как^{пептид 10,}белок^11,ДНК^12,РНК¹³и сахар^14. В этой технике существует два вида бусин (диаметр 200 нм), один из них является донорской бусиной, а другой – акцепторной бусиной. Биомолекулы иммобилизуются на эти шарики; их биологические взаимодействия приводят к сближению бусин донора и акцептора. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Поскольку синглетный кислород имеет короткое время жизни, он может диффундировать только до 200 нм. Если шарик акцептора находится в непосредственной близости, его производное тиоксена реагирует с синглетным кислородом, генерируя хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм^15. Если биологические взаимодействия нарушаются, акцепторная бусина и донорская бусина не могут достичь близости, что приводит к распаду синглетного кислорода и низкому образуемого сигнала.

Здесь мы описываем протокол, использующий этот метод для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и TPR ко-шаперонами, особенно FKBP51 и FKBP52. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Очищенные GST-помеченные ко-шапероны TPR взаимодействуют с донорскими шариками, связанными с глутатионом. Когда взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и ко-шаперонами TPR-мотива сближает шарики, образуется усиленный сигнал(рисунок 1A). Если экранированные малые молекулы могут ингибировать взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами, этот усиленный сигнал будет уменьшен(рисунок 1B). Их IC₅₀ может быть рассчитан путем количественного измерения. Этот протокол может быть распространен на любые интересующих взаимодействия шаперона – TPR-мотива и имеет большое значение в разработке новых молекул, в частности блокирующих взаимодействие между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52.

Рисунок 1:Основной принцип этого анализа. (A) Очищенный GST-FKBP51 взаимодействует с глутатион-связанными донорскими шариками. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и доменом TPR FKBP51 приближает донорские и акцепторные шарики. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Производное тиоксена на акцепторной бусине реагирует с синглетным кислородом и генерирует хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм. (B) Когда малые молекулы ингибируют взаимодействия между Hsp90 и FKBP51, донорские и акцепторные шарики не могут достичь близости. Затем синглетный кислород с коротким сроком службы распадается, и не вырабатывается обнаруживаемый сигнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.