대식세포식세포의 중간엽 줄기세포 조절; 수량 및 이미징
Summary
여기에 제시된 것은 pH 에 민감한 형광 분자에 공주되는 비협화효모(zymosan) 입자의 대식세포(MΦ) 식세포증의 중간엽 줄기세포(MSC) 중재조절의 동적 이미지를 정량화하고 생성하는 프로토콜이다.
Abstract
중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 전통적으로 그들의 재생 특성에 대 한 공부 되었습니다., 하지만 더 최근에, 그들의 면역 조절 특성 최전선에 있다. 그(것)들은 면역 세포 활동과 상호 작용하고 통제합니다. 이 연구의 초점은 대식세포 활성의 MSC 조절입니다. 대식세포(MΦ) phagocytosis는 감염에 대한 선천적인 면역 계통 반응의 중요한 부분이며, MSC가 이 반응을 조절하는 메커니즘은 적극적인 조사를 받고 있습니다. 여기에 제시된 MΦ phagocytosis의 비편화 된 자모산 입자를 pH 에 민감한 형광 분자에 접합 하는 방법 MSC와 공동 배양 하는 동안. 식세포 활성이 증가하고 표지된 zymosan 입자가 phagolysosome의 산성 환경 내에서 동봉됨에 따라 pH 에 민감한 분자의 형광 강도가 증가합니다. 적절한 발각 및 방출 파장으로, 식세포 활성은 형광 분광계를 사용하여 측정되고 운동 데이터는 70 분 동안 상대 형광 단위의 변화로 제시된다. 이 정량적 데이터를 지원하기 위해, phagocytic 활동의 변화는 동적 이미징을 사용하여 시각화됩니다. 이 방법을 사용한 결과는 공동 배양시 MSC가 순진한 및 IFN-γ 처리MΦ의 비편화 자모산의 MΦ phagocytosis를 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 이 데이터는 선천적인 면역 계통의 MSC 규정의 현재 지식에 추가합니다. 이 방법은 근본적인 세포 및 분자 기계장치를 완전히 묘사하기 위하여 미래 조사에 적용될 수 있습니다.
Introduction
중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 결합 조직 세포를 초래하는 전구 세포입니다. MSC는 성인 포유류 조직에 존재하며 골수1로부터분리 될 수 있습니다. 그들의 면역 조절 특성 때문에, 이들 세포는 널리 연구된다2. T세포3,4,5,6의 MSC 조절에 초점을 맞춘 초기 연구는 최근에는 선천성 면역의 주요 세포 성분인 대식세포 세포(MΦ)의 조절에 초점을 맞추고 있으며,7, 8,9,10,11,12,13,14의 증가된 관심을 받고 있습니다. . 염증성 질환의 치료에 있는 MSC-MΦ 상호작용의 중요성은 동물 모델8에서단핵구/대식세포의 고갈이 MSC의 치료 효과를 흡수한다는 사실에 의해 강조된다. 여기서, 초점은 MΦ와 MSC의 세포 접촉 상호 작용이다. MSC는 염증에서 항염증 반응으로의 전환을 촉진하여 MΦ의 표현형을 조절할 수 있는 능력을 가지며, 조직 수리 활동8,9,10,11로이어지는 이러한 조절 메커니즘을 입증하기 위해 많은 작업을 수행하였다. 다른 상황에서, MSC는 MΦ 구동 염증반응을지원하거나 악화시킬 수 있으며,13, 13및 MΦ phagocytic 활동을 향상시킬 수있습니다(14,15). 그러나 MSC가 MΦ phagocytic 활동을 조절하는 메커니즘과 조건을 식별하는 기존 데이터가 매우 부족합니다.
MΦ는 협소화(항체 또는 보체 코팅) 또는 비편화병원균(16)을인식하는 수용체의 제품군을 가지고 있다. 후자의 활성화 및 활동은 덜 잘 연구17. 비염증성 체외 환경에서, MSC는 비편성병원체(13)의MΦ phagocytosis를 향상시킵니다. 그러나, MΦ에 의한 비편화 병원균의 인식은 적응성 면역 반응 도중 림프구에 의해 생성된 선동적인 환경에 노출 후에 감소될 수 있다. 자연 킬러 세포및 이펙터 림프구에 의해 방출되는 IFN-γ, 비응진입자(18)의MΦ phagocytosis에 대한 억제 효과가 있다. MΦ phagocytosis의 MSC 직접 접촉 조절의 메커니즘을 연구하기 위해 공동 배양 모델이 개발되었습니다. 여기서 제시된 실험의 목적은 MSC가 MΦ가 IFN-γ(도1)에노출된 후 비편화 병원체의 MΦ phagocytosis를 조절하는지 여부를 결정하는 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
pH 에 민감한 염료에 컨쥬커드된 생체입자를 이용한 식세포증의 분석은 기존의 형광표지입자(12,19,20)에비해 유리하다는 비교적 새로운 도구이다. 기존의 형광 라벨 입자를 사용하면 엔드 포인트 분석만 가능합니다. 검출은 식세포에 의해 채택되지 않은 입자를 세척하거나 담금질 한 후 형광 현미경 검사및 /또는 분광로메로 수…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 1626093 및 1919583 보조금 수에 따라 NSF 주요 연구 기기 메커니즘에 의해 지원되었다.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
