중추 신경계의 흥분 시냅스의 대부분은 수지상 척추에 위치합니다 – 신경 막의 작은 돌출. 이러한 돌출은 세포내 신호 변환을 제어하는 제한된 생화학 적 구획을 형성합니다. 수지상 척추 및 시냅스의 구조적 가소성은 학습 및 메모리^1,2와 같은 중요한 과정의 기초가 되는 시냅스 효능의 기능적 변화와 밀접한 관련이^있다. 전자 현미경 검사법(EM)은 수지상 척추에 사전 시냅스 입력이 있는지 확인할 수 있는 유일한 기술입니다. EM 해상도는 또한 시냅스의 포스트냅스 부분 또는 수지상 척추의 치수를 나타내는 포스트 냅스 밀도(PSD)의 모양과 같은 초구조적 세부 사항뿐만 아니라 축삭 부톤의 크기와 모양을 연구하는 데 필요합니다. 또한 EM을 사용하면 시냅스와 주변 환경을 시각화할 수 있습니다.

이미징 및 컴퓨팅 기술의 발전 덕분에 전체 신경 회로를 재구성할 수 있습니다. 직렬 단면 투과 전자 현미경 검사법(ssTEM), 직렬 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경검사(SBEM), 및 집중이온 빔 스캐닝 전자 현미경검사법(FIB-SEM)과 같은 부피 전자 현미경 기술은 일반적으로 뉴런 회로 재구성^3에사용된다.

우리의 연구에서, SBEM 방법은 마우스 해마와 조직 뇌 슬라이스 ^4,5의샘플에서 수지상 척추와 PSDs의 구조적 가소성을 조사하기 위해 성공적으로 채택된다. SBEM은 스캐닝 전자 현미경 챔버^6,7,8,9내부에 소형 초미세토메를 설치하는 것을 기반으로 한다. 샘플 블록의 상단은 이미지화되고, 샘플은 초미세토메에 의해 지정된 깊이로 절단되어 새로운 블록 면을 드러내며, 이는 다시이미지화된 다음 프로세스가 8반복된다. 그 결과, 절단된 슬라이스가 파편으로 손실되는 동안 블록 페이스의 이미지만 남게 됩니다. 그렇기 때문에 SBEM은 파괴적인 기술이라고 불리며, 이는 동일한 장소를 다시 이미지화할 수 없다는 것을 의미합니다. 그러나, 파괴적인 온블록 방법의 장점은 데이터 품질 및 데이터 분석^3에크게 영향을 미칠 수 있는 뒤틀기 문제 및 절제손실로 인해 손해를 입지 않는다는 것이다. 또한, SBEM은 고해상도^3에서상대적으로 넓은 시야(> 0.5mm × 0.5mm)를 이미지화할 수 있는 가능성을 제공한다.

SBEM을 사용하려면 이미지를 획득하는 데 사용되는 백산전자 검출기로 인해 전담적이고 대조적인 프로토콜에 따라 샘플을 준비해야 합니다. 1980년대^8,11에서개발된 소슘-티오카르보히드라지데-오스뮴(rOTO) 얼룩을 사용하여 Deerinck^10(국립 현미경 및 이미징 연구 센터(NCMIR) 방법에 의해 개발된 절차에 따라 시료 준비를 수행하는 방법을 여기에서 보여 준다. 또한 가벼운 현미경 검사법과 SBEM을 사용하여 면역 형광 연구에 동일한 뇌를 사용할 수있는 가벼운 고정 관류와 함께 2 단계 고정 접근 법을 소개합니다.

프로토콜에서 마우스 뇌는 주로 가벼운 고정제로 고정된 다음 반구로 절단한 다음, 한 반구는 면역 형광(IF)을 위해 포스트 고정 및 준비되고, 다른 하나는 EM 연구를 위한반면(그림 1).

그림 1. SBEM을 통해 분석을 위한 수지상 척추 준비에 대한 워크플로우의 회로도 표현. 마우스는 희생되고 온화한 1 차 고정으로 perfused되었습니다. 뇌는 반으로 절단되었고, 한 반구는 면역 형광 (IF)전용 고정, 냉동 보호, 극저온을 사용하여 슬라이스하고 IF 연구를 위해 처리되었으며, 다른 반구는 EM 고정으로 후징되고 진동체로 슬라이스되어 EM 연구를 준비했습니다. SBEM 연구를 위한 뇌 슬라이스는 대조되고, 수지에 평평한 내장, 해마의 CA1 부위가 핀에 장착되고, SBEM(도1)으로이미지되었다. 노란색 상자에 강조 표시된 프로토콜의 일부가 비디오에 등장했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.