Uso di ultrasuoni robotici 3D per l'analisi in vivo dei reni di topo
Summary
Questo protocollo dimostra l’ecografia robotica (US) come un’alternativa pratica, economica e rapida alle tradizionali modalità di immagine non invasive.
Abstract
Le modalità comuni per l’imaging in vivo dei roditori includono la tomografia ad emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata (TC), la risonanza magnetica (MRI) e gli ultrasuoni (US). Ogni metodo presenta limitazioni e vantaggi, tra cui disponibilità, facilità d’uso, costi, dimensioni e l’uso di radiazioni ionizzanti o campi magnetici. Questo protocollo descrive l’uso di US robotici 3D per l’imaging in vivo di reni e cuore di roditori, successiva analisi dei dati e possibili applicazioni di ricerca. Le applicazioni pratiche degli Stati Uniti robotici sono la quantificazione del volume totale dei reni (TKV), nonché la misurazione di cisti, tumori e vascolarizzazione. Sebbene la risoluzione non sia così alta come altre modalità, la robotica statunitense consente una raccolta di dati ad alta produttività più pratica. Inoltre, utilizzando l’imaging in modalità M degli Stati Uniti, la funzione cardiaca può essere quantificata. Poiché i reni ricevono il 20% -25% della gittata cardiaca, la valutazione della funzione cardiaca è fondamentale per la comprensione della fisiologia e della fisiopatologia renale.
Introduction
Le modalità più comuni per l’imaging dei roditori in vivo includono la tomografia ad emissione di positroni (PET), l’imaging ottico (OI), la tomografia computerizzata (CT), la risonanza magnetica (MRI) e gli ultrasuoni (US). Queste tecniche forniscono immagini in vivo ad alta risoluzione, consentendo ai ricercatori di valutare quantitativamente e seguire longitudinalmente i modelli di malattia in modo non invasivo1. Mentre ogni modalità di imaging ha dei limiti, forniscono anche strumenti inestimabili per la ricerca preclinica.
Qui, lo studio descrive in dettaglio un sistema statunitense e presenta il protocollo per l’imaging robotico e 3D dei roditori. Le onde statunitensi sono prodotte da una sonda chiamata trasduttore, che è tipicamente portatile. Le onde sonore vengono riflesse mentre interagiscono con i tessuti e gli echi vengono ricostruiti in immagini2. Il protocollo qui descritto si concentrerà sull’imaging renale e cardiaco utilizzando un trasduttore controllato roboticamente e utilizzando un software che consente una rapida ricostruzione 3D per la valutazione quantitativa.
Robotic US è una modalità di imaging veloce, affidabile e non invasiva che consente agli investigatori di condurre studi longitudinali e ad alto rendimento. Rispetto ai metodi statunitensi portatili, il metodo robotico statunitense è efficiente in termini di tempo, poiché è possibile scansionare fino a tre animali in pochi minuti. L’elevata produttività per le misurazioni renali suggerisce che possono essere ripresi fino a 20 topi all’ora. I trasduttori robotici si trovano sotto le membrane acustiche e si muovono indipendentemente dall’animale con due gradi di libertà (Figura 1A). Ciò consente agli utenti inesperti di ottenere immagini di alta qualità, mentre i metodi statunitensi portatili sono più suscettibili all’errore dell’utente. Il software accoppiato consente una ricostruzione renale 3D efficiente e in tempo reale. In precedenza, la risonanza magnetica (MRI) è stata un metodo prevalente per l’imaging non invasivo a causa dell’eccellente contrasto dei tessuti molli, della mancanza di radioattività e della profondità di penetrazione. Tuttavia, la risonanza magnetica richiede spesso lunghi tempi di acquisizione ed è costosa da eseguire. Gli Stati Uniti sono stati valutati come un’alternativa affidabile e più rapida alla risonanza magnetica nella valutazione del volume renale totale (TKV)3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli ultrasuoni utilizzano onde sonore e qualsiasi barriera alla propagazione delle onde sonore interferirà con la qualità dell’immagine. Pertanto, la rimozione completa dei peli dell’area da visualizzare è fondamentale. È anche importante garantire la completa rimozione della crema depilatoria in quanto può causare ustioni / irritazioni della pelle dell’animale e scolorire la membrana trasparente dello scanner. Livelli d’acqua adeguati nelle baie sono necessari per una propagazione ottimale delle onde sonore, quindi necessari per ottenere la massima risoluzione dell’immagine. Tuttavia, quando l’animale è in posizione prona, assicurarsi che il muso dell’animale sia al di sopra del livello dell’acqua o che l’animale sia a rischio di inalazione di acqua. L’ottimizzazione dei parametri di imaging, in particolare la profondità focale, è fondamentale per ottenere immagini di alta qualità. Possono essere necessarie modifiche ai parametri per i singoli animali.
Robotic US offre molti vantaggi rispetto alle tradizionali modalità portatili statunitensi. Innanzitutto, il sistema utilizza una semplice interfaccia point-and-click basata sulla fotocamera. Questa funzione affronta la complessità degli Stati Uniti convenzionali e produce dati coerenti anche se gestito da un utente inesperto6. In secondo luogo, il sistema consente l’uso di acqua piuttosto che il tradizionale gel statunitense come mezzo acustico. In precedenza, l’uso del gel statunitense consentiva la formazione di bolle che interferivano con l’acquisizione di immagini di qualità. Inoltre, il gel statunitense è disordinato e offre sfide per la pulizia. Inoltre, l’acqua viene riscaldata dalla lampada di calore e aiuta a mantenere la temperatura corporea dell’animale. In terzo luogo, gli Stati Uniti robotici sono più veloci, quindi gli artefatti del movimento respiratorio non sono problematici. La maggiore velocità di imaging consente il completamento pratico della raccolta dati ad alto throughput. In quarto luogo, gli Stati Uniti robotici ottengono immagini 3D e quindi semplificano la ricostruzione 3D degli oggetti (Figura 4). La risonanza magnetica e altre modalità sono costose, dispendiose in termini di tempo e non sempre disponibili. È importante sottolineare che il sistema robotico statunitense si adatta a un tavolo o a una panca ed è più economico. Infine, il lavoro precedente ha dimostrato che gli Stati Uniti robotici potrebbero fornire dati di misurazione comparabili a modalità più costose, come la risonanza magnetica3.
Mentre la qualità dell’immagine e la risoluzione del sistema robotico statunitense descritto in questo lavoro erano adeguate per l’applicazione proposta (Figura 7), ci sono diversi modi in cui la qualità dell’immagine può essere migliorata in futuro. Ad esempio, l’utilizzo di trasduttori a frequenza più elevata (ad esempio, 50-70 MHz) comporterebbe immagini a risoluzione più elevata con una migliore definizione delle funzionalità. Mentre l’utilizzo di frequenze più elevate comporterebbe una minore profondità di penetrazione, le immagini dovrebbero essere sufficienti per l’imaging in vivo di organi superficiali, come il rene del topo. Come con altre modalità di imaging, gli agenti di contrasto possono essere utilizzati per migliorare caratteristiche specifiche. Per gli Stati Uniti, questo in genere significa usare qualcosa di altamente riflettente delle onde sonore. Le microbolle intravascolare in cui i lipidi circondano bolle di gas molto piccole sono uno di questi agenti. Le bolle di gas delle dimensioni di un micron sono altamente riflettenti e forniscono quindi un secondo segnale distinto che si traduce in un’alta risoluzione della vascolarizzazione7. Mentre questa tecnica di contrasto acustico può essere molto utile, può avere diversi aspetti negativi. In primo luogo, le microbolle devono essere rese fresche e persistono solo in vivo per 5-10 minuti. In secondo luogo, l’iniezione intravascolare in vivo richiede in genere il cateterismo del velo di coda per l’iniezione, e questo può essere tecnicamente impegnativo. In determinate circostanze e regimi pulsanti, l’imaging a microbolle può portare a causa di danni alla vascolarizzazione renale8.
Ci sono anche alcune limitazioni più generali del particolare sistema statunitense utilizzato. Innanzitutto, solo un array lineare (centrato a 18 MHz) è incluso nello chassis robotico, quindi il passaggio a sonde a frequenza più alta o inferiore non è attualmente possibile. Ciò può influire sull’ampiezza dei modelli (più grandi o più piccoli) che possono essere valutati con il sistema. Le future iterazioni dello strumento dovrebbero includere più array lineari per coprire l’intera gamma di modelli animali preclinici. In secondo luogo, l’angolo del trasduttore rispetto al soggetto animale non può essere controllato. Pertanto, l’esecuzione di tecniche di imaging dipendenti dall’angolo, come il Doppler, o il raggiungimento di viste alternative sul piano di alcuni organi (ad esempio, la vista dell’asse lungo del rene) richiede il riposizionamento dell’animale e può essere difficile da raggiungere. Ulteriori gradi di libertà potrebbero essere aggiunti al movimento robotico per migliorare questa sfida. In terzo luogo, a volte, abbiamo osservato artefatti di riverbero derivanti dalla membrana acustica che separa l’animale dal trasduttore che possono oscurare la visualizzazione di caratteristiche e confini superficiali. In questi casi, l’uso di un supporto in gel per sollevare l’animale lontano dalla membrana può porre rimedio alla situazione. Infine, il controllo della temperatura tramite lampada di calore è impreciso e quindi è necessario prestare molta attenzione alla temperatura corporea interna dell’animale durante l’imaging. Meccanismi di riscaldamento più controllati, come una piastra riscaldante integrata, probabilmente miglioreranno la gestione dell’omeostasi e la produttività dell’imaging.
L’uso di US robotici può essere applicabile a vari campi di ricerca. Questa tecnologia consente la visualizzazione delle strutture tissutali grossolane, quindi può essere utilizzata per tracciare la progressione del tumore e le potenziali terapie6,9, nonché la morfologia renale come qui presentata. La capacità di segmentare le caratteristiche specifiche delle immagini lo rende uno strumento interessante per lo studio di modelli di malattia del rene policistico (PKD)3. Le immagini in modalità M consentono una semplice quantificazione di molti importanti parametri cardiaci che consentono la valutazione in vivo della fisiologia cardiaca. Poiché i reni ricevono il 20%-25% della gittata cardiaca10, è importante comprendere la funzione cardiaca durante la valutazione longitudinale della patologia renale. Attraverso questi protocolli statunitensi, abbiamo cercato di illustrare che l’imaging statunitense non è solo pratico per studi renali in vivo e longitudinali, ma anche che sempre più strumenti statunitensi consentono la valutazione morfologica e fisiologica dei topi negli studi preclinici.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH (R43-DK126607, TJC, TLK, MFR) e dalla Mayo Foundation.
Materials
| Electric Razor | Braintree Scientific, Inc | CLP-9868 14 | |
| C57bk6j | The Jackson laboratory | https://www.jax.org/ | |
| Cotton gauze pads | Fisher Scientific | ||
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | ||
| Depilatory cream | N/a | N/a | This study used Nair |
| Heat lamp | Included with SonoVol Vega system | ||
| Robotic Ultrasound System | SonoVol Inc | SonoVol Vega system includes anesthesia system | |
| SonoEQ Software | SonoVol | Included with SonoVol Vega system | |
| TERRELL Isoflurane | Piramal Critical Care, Inc | NDC 66794-019-10 |
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