פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.
Abstract
פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי ליצור פרופילים של ריבוזומים, לזהות mRNA ספציפיים המתורגמים על ידי ריבוזומים, ולנתח גורמים הקשורים לפוליזום. בעוד שיצרני שיפועים אוטומטיים ומערכות פיצול הדרגתיות משמשים בדרך כלל בטכניקה זו, מערכות אלה הן בדרך כלל יקרות ויכולות להיות יקרות עבור מעבדות שיש להן משאבים מוגבלים או שאינן יכולות להצדיק את ההוצאה בשל הצורך הנדיר או המזדמן שלהן לבצע שיטה זו עבור המחקר שלהן. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילי פוליזום באמצעות ציוד סטנדרטי הזמין ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית ללא מכשירי פיצול מיוחדים. יתר על כן, ניתנת השוואה של פרופילי פוליזום שנוצרו עם ובלי מערכת פיצול הדרגתית. נדונו אסטרטגיות למיטוב וייצור פרופילי פוליזום הניתנים לשחזור. Saccharomyces cerevisiae משמש כאורגניזם מודל בפרוטוקול זה. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להשתנות בקלות ולהתאים ליצירת פרופילי ריבוזום עבור אורגניזמים וסוגי תאים רבים ושונים.
Introduction
ריבוזומים הם קומפלקסים מגה-דלטון ריבונוקלאופרוטאין המבצעים את התהליך הבסיסי של תרגום mRNA לחלבונים. ריבוזומים אחראים על ביצוע הסינתזה של כל החלבונים בתוך התא. ריבוזומים אאוקריוטים מורכבים משתי תת-יחידות המוגדרות כתת-יחידה ריבוזומלית קטנה (40S) ותת-יחידה ריבוזומלית גדולה (60S) על פי מקדמי המשקעים שלהן. הריבוזום המורכב במלואו מוגדר כמונוזום 80S. פוליזומים הם קבוצות של ריבוזומים העוסקים בתרגום מולקולת mRNA יחידה. פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז היא שיטה רבת עוצמה המשמשת ליצירת פרופילי ריבוזום, זיהוי mRNA ספציפיים הקשורים לתרגום ריבוזומים וניתוח גורמים הקשורים לפוליזום 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. טכניקה זו משמשת לעתים קרובות להפרדת פוליסומים מריבוזומים בודדים, תת-יחידות ריבוזומליות וחלקיקי ריבונוקלאופרוטאין שליחים. הפרופילים המתקבלים מהפיצול יכולים לספק מידע רב ערך לגבי פעילות התרגום של פוליזומים14 ומצב ההרכבה של הריבוזומים15,16,17.
הרכבת ריבוזום היא תהליך מורכב מאוד המתאפשר על ידי קבוצה של חלבונים הידועים כגורמי הרכבה ריבוזום 18,19,20,21. גורמים אלה מבצעים מגוון רחב של פונקציות במהלך ביוגנזה של ריבוזום באמצעות אינטראקציות עם חלבונים רבים אחרים, כולל ATPases, אנדו ואקסו-נוקלזים, GTPases, RNA helicases וחלבונים קושרי RNA22. פיצול פוליזום היה כלי רב עוצמה המשמש לחקר תפקידם של גורמים אלה בהרכבת ריבוזום. לדוגמה, שיטה זו שימשה כדי להדגים כיצד מוטציות בפולינוקלאוטיד קינאז Grc3, גורם עיבוד קדם-rRNA, יכולות להשפיע לרעה על תהליך הרכבת הריבוזום17,23. פרופיל פוליזום גם הדגיש והראה כיצד המוטיבים המשומרים בתוך ATPase Rix7 חיוניים לייצור ריבוזום16.
ההליך לפיצול פוליזום מתחיל ביצירת תאים מסיסים מתאי עניין. הליזאט מכיל RNA, תת-יחידות ריבוזומליות ופוליזומים, כמו גם רכיבים תאיים מסיסים אחרים. שיפוע סוכרוז רציף וליניארי נוצר בתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה. החלק המסיס של ליזאט התא נטען בעדינות על החלק העליון של צינור גרדיאנט סוכרוז. לאחר מכן, צינור השיפוע הטעון נתון לצנטריפוגה, המפרידה בין הרכיבים התאיים לפי גודלם בתוך שיפוע הסוכרוז בכוח הכבידה. הרכיבים הגדולים יותר נעים רחוק יותר לתוך השיפוע מאשר הרכיבים הקטנים יותר. החלק העליון של השיפוע מכיל את הרכיבים התאיים הקטנים והאיטיים יותר, ואילו הרכיבים הסלולריים הגדולים והמהירים יותר נמצאים בתחתית. לאחר צנטריפוגה, התוכן של הצינור נאספים כשברים. שיטה זו מפרידה ביעילות בין תת-יחידות ריבוזומליות, מונוזומים ופוליסומים. הצפיפות האופטית של כל שבר נקבעת לאחר מכן על ידי מדידת הבליעה הספקטרלית באורך גל של 254 ננומטר. התוויית ספיגה לעומת מספר שבר מניבה פרופיל פוליזום.
ניתן ליצור מעברי צבע ליניאריים של צפיפות סוכרוז באמצעות יצירת מעבר צבע. לאחר צנטריפוגה, שיפועים מופרדים לעתים קרובות, וסופגות נמדדות באמצעות מערכת פיצול צפיפות אוטומטית 3,7,13,24,25. בעוד שמערכות אלה פועלות היטב כדי לייצר פרופילים פוליזומיים, הן יקרות ועלולות להיות יקרות עבור מעבדות מסוימות. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש בכלים אלה. במקום זאת, פרוטוקול זה משתמש בציוד הזמין בדרך כלל ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן תוארה שיטה ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש במערכות פיצול אוטומטיות יקרות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מנגישה פרופיל פוליזום למעבדות שאין להן מערכות פיצול אוטומטיות. החסרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם פיצול ידיים מייגע ורגישות מופחתת בהשוואה למערכת פיצול הצפיפות הייעודית.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר פרסי טומבלה ולד”ר מליסה וולס על קריאתם הביקורתית של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של ארה”ב לבריאות תוכנית מחקר תוך-מוחית; המכון הלאומי של ארה”ב למדעי בריאות הסביבה (NIEHS; ZIA ES103247 ל- R.E.S).
Materials
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E. Eukaryotic ribosome assembly. Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
