Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa
Summary
Transferência de energia de fluorescência de molécula única é um método que rastreia a dinâmica do tRNA durante a síntese de proteína ribossômica. Ao rastrear ribossomos individuais, são identificadas populações inhomogêneas, que lançam luz sobre mecanismos. Este método pode ser usado para rastrear mudanças conformacionais biológicas em geral para revelar relações de função dinâmica em muitos outros biossistemas complexos. Métodos de molécula única podem observar etapas limitantes sem taxa e intermediários-chave de baixa população, que não são acessíveis por métodos convencionais de conjunto devido ao efeito médio.
Abstract
O ribossomo é um grande complexo de ribonucleoproteína que reúne proteínas processivamente ao longo de modelos de mRNA. O diâmetro do ribossomo é de aproximadamente 20 nm para acomodar substratos de tRNA grandes nos locais A, P e E. Consequentemente, a dinâmica ribossoma é naturalmente desagum rapidamente. O método de molécula única pode detectar cada ribossomo separadamente e distinguir populações inhomogêneas, o que é essencial para revelar os complicados mecanismos dos sistemas multicomponimentos. Relatamos os detalhes de um método smFRET baseado no microscópio invertido Nikon Ti2 para sondar a dinâmica ribossômica entre a proteína ribossômica L27 e tRNAs. O L27 é rotulado em sua posição cys 53 única e reconstituído em um ribossomo que é projetado para falta de L27. O tRNA é rotulado em sua região do cotovelo. À medida que o tRNA se move para diferentes locais dentro do ribossomo durante o ciclo de alongamento, como a pré e pós-translocação, as eficiências e dinâmicas do FRET apresentam diferenças, que sugeriram múltiplas subpopulações. Essas subpopulações não são detectáveis por métodos de conjunto. O microscópio smFRET baseado em TIRF é construído sobre um microscópio invertido manual ou motorizado, com iluminação laser construída em casa. As amostras de ribossomo são purificadas por ultracentrifugação, carregadas em uma célula de amostra multicanal construída em casa e depois iluminadas através de um campo laser evanescente. O ponto laser de reflexão pode ser usado para alcançar o controle de feedback do foco perfeito. Os sinais de fluorescência são separados por uma torre de filtro motorizada e coletados por duas câmeras CMOS digitais. As intensidades são recuperadas através do software NIS-Elements.
Introduction
O ribossomo é um complexo de ribonucleoproteína de 20 nm de grande porte de uma subunidade grande (50S) e uma pequena (30S). Ele monta peptídeos longos ao longo do modelo mRNA de forma processiva e cooperativa. O ribossomo 30S se liga ao fMet-tRNAfMet e mRNA para iniciar a síntese proteica, e o 50S então se junta para formar o complexo de iniciação 70S. Os tRNAs trazem aminoácidos para o ribossomo no local A (local de ligação aminoacyl-tRNA), enquanto a cadeia de peptidyl alongada é mantida no local P (peptidyl-tRNA binding site). No complexo de pré-translocação, a cadeia de peptidyl é transferida para o tRNA no local A com um aminoácido adicionado. Enquanto isso, o tRNA p-site está desativado. Em seguida, os A-, P-tRNAs movem-se para os locais P-, E-para formar o complexo pós-translocação, no qual o E-site representa o local de saída do tRNA. Neste estado, o peptidyl-tRNA volta para o local P. O ciclo de alongamento continua entre as pré e pós-conformações enquanto o ribossomo transloca no mRNA, um codon de cada vez1. O ribossomo é altamente coordenado de diferentes locais funcionais para tornar esse processo eficiente e preciso, como a catraca inter-subunidade2, as flutuações de hibridização do tRNA3,as ativações GTPase4,L1 stalk opening-closing5, etc. Consequentemente, ribossomos rapidamente se desfantemem porque cada molécula se move em seu próprio ritmo. Os métodos convencionais só podem deduzir parâmetros médios aparentes, mas espécies de baixa população ou de curta duração serão mascaradas no efeito médio6. O método de molécula única pode quebrar essa limitação detectando cada ribossomo individualmente, e então identificar diferentes espécies através da reconstrução estatística7. Diferentes sites de rotulagem foram implementados para sondar dinâmicas ribossósmos, como as interações entre tRNA-tRNA8,EF-G-L119,L1-tRNA10,etc. Além disso, rotulando as subunidades grandes e pequenas, respectivamente, cinéticas de catraca inter-subunidade e coordenação com fatores são observadas11,12. Enquanto isso, o método smFRET tem amplas aplicações em outros processos biológicos centrais, e métodos FRET multicolorentes estão surgindo13.
Anteriormente, um novo par de FRET ribossomo foi desenvolvido14,15. A proteína ribossômica recombinante L27 foi expressa, purificada e rotulada, e incorporada de volta ao ribossomo. Essa proteína interagiu com os tRNAs a uma distância próxima e ajudou a estabilizar o tRNA do local P no complexo pós-translocação. Quando o tRNA mudou do A- para o local P, a distância entre essa proteína e o tRNA é encurtada, o que pode ser distinguido pelo sinal smFRET. Múltiplas subpopulações ribossas foram identificadas usando métodos estatísticos e mutagênese, e a troca espontânea dessas populações no complexo pré-, mas não pós-translocação, sugere que o ribossomo é mais flexível antes de seguir em frente ao mRNA, e mais rígido durante a decodificação16,17,18. Essas variações são essenciais para a função ribossosome. Aqui, o protocolo descreve os detalhes da rotulagem/tRNA ribossomo/tRNA, sua incorporação no ribossomo, preparação da amostra smFRET e aquisição/análise de dados19.
Protocol
Representative Results
Discussion
O SmFRET é sensível aos sinais de fundo. Primeiro, é necessário revestir a câmara de amostra com 0,05% de interpolação e, em seguida, ser adicionado simultaneamente com a solução ribossosome para bloquear a ligação não específica do ribossomo à superfície. Para ver fluorescência da emissão de Cy5 aceitante, o coquetel de catadores de oxigênio (soluções de desoxi, glicose e Trolox) é essencial. Sem essa solução, o branqueamento é muito rápido no canal de aceitação para obter informações úteis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01GM111452) e pela Fundação Welch (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
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