Chromosomen-Screening von humanen Präimplantationsembryonen unter Verwendung von verbrauchtem Kulturmedium: Probenentnahme und Chromosomenploidie-Analyse
Summary
Die vorliegende Studie berichtet über ein Protokoll für das Chromosomen-Screening menschlicher Embryonen, das verbrauchtes Kulturmedium verwendet, das eine Embryonenbiopsie vermeidet und die Identifizierung der Chromosomenploidie mittels NGS ermöglicht. Der vorliegende Artikel stellt das detaillierte Verfahren vor, einschließlich der Herstellung des Nährmediums, der Amplifikation des gesamten Genoms (WGA), der Vorbereitung der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek (NGS) und der Datenanalyse.
Abstract
Bei der klinischen In-vitro-Fertilisation (IVF) erfordert die vorherrschende Methode für PGT-A die Biopsie einiger Zellen aus dem Trophektoderm (TE). Dies ist die Abstammungslinie, die die Plazenta bildet. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Fähigkeiten, ist invasiv und leidet unter falsch-positiven und negativen Ergebnissen, da die Chromosomenzahlen im TE und die innere Zellmasse (ICM), die sich zum Fötus entwickelt, nicht immer gleich sind. NICS, eine Technologie, die die Sequenzierung von DNA erfordert, die sowohl von TE als auch von ICM in das Nährmedium freigesetzt wird, könnte einen Ausweg aus diesen Problemen bieten, hat sich aber bisher als begrenzt wirksam erwiesen. Die vorliegende Studie berichtet über das vollständige NICS-Protokoll, das Methoden zur Probenahme von Nährmedien, zur Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) und zur Bibliotheksvorbereitung sowie zur NGS-Datenanalyse durch Analysesoftware umfasst. In Anbetracht der unterschiedlichen Kryokonservierungszeiten in verschiedenen Embryonenlabors stehen den Embryologen zwei Methoden zur Entnahme des Embryokulturmediums zur Verfügung, die je nach den tatsächlichen Bedingungen des IVF-Labors ausgewählt werden können.
Introduction
Assistierte Reproduktionstechnologien (ARTs) werden zunehmend zur Behandlung von Unfruchtbarkeit eingesetzt. Die Erfolgsrate von ART, wie z. B. IVF, ist jedoch begrenzt, und die Rate der Fehlgeburten ist deutlich höher als die der Normalbevölkerung1. Die Hauptursache für diese Probleme sind Chromosomenanomalien, die häufig bei menschlichen Präimplantationsembryonen auftreten2. PGT-A ist eine wirksame Methode zum Screening von Embryonen auf Chromosomengleichgewicht vor der Implantation 3,4. Einige Studien haben bewiesen, dass PGT-A die Abtreibungsrate senken und die Schwangerschaftsrate verbessern kann 5,6,7,8. PGT-A erfordert jedoch komplexes technisches Fachwissen, das eine spezifische Ausbildung und Erfahrung erfordert. Die invasive Embryonenbiopsie kann auch zu einer Schädigung der Embryonen führen9. Studien haben gezeigt, dass die Blastomerbiopsie die spätere Entwicklung behindern kann und die Anzahl der biopsierten TEs die Implantationsraten beeinflussen kann10. Obwohl das Problem der langfristigen biologischen Sicherheit der Embryonenbiopsie beim Menschen noch nicht gründlich untersucht wurde, haben Tierstudien gezeigt, dass sie negative Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung hat11,12,13.
Frühere Berichte deuteten darauf hin, dass während der Embryonalentwicklung Spuren von DNA-Material in das Kulturmedium abgesondert wurden, und es wurden Anstrengungen unternommen, ein umfassendes Chromosomen-Screening (CCS) mit verbrauchtem Embryokulturmedium durchzuführen 14,15,16,17,18. Die Nachweisraten und die Genauigkeit der Tests haben jedoch nicht die Anforderungen für einen umfassenden klinischen Einsatz erfüllt. Die vorliegende Studie berichtete über eine Verbesserung des NICS-Assays zur Erhöhung der Detektionsraten sowie der Genauigkeit des NICS-Tests19. In den letzten Jahren wurde Blastocoele-Flüssigkeit (BF) als analytische Probe der minimalinvasiven PGT-A untersucht. Der Anteil der erfolgreichen genomweiten Amplifikation und der nachweisbaren DNA in Blastozystenflüssigkeitsproben liegt jedoch zwischen 34,8 % und 82 %20,21,22. Das in verschiedenen Studien berichtete BF-Volumen reicht von 0,3 nL bis 1 μL. Angesichts der geringen Menge an DNA in BF ist es möglich, die Menge an zellfreier DNA durch Mischen von Blastozystenflüssigkeit und Kulturmedium zu erhöhen, um die Erfolgsrate und Konsistenz des Nachweises zu verbessern. Kuznyetsov et al.23 und Li et al.24 behandelten die Zona pellucida mit einem Laser und setzten Blastozystenflüssigkeit in das Kulturmedium frei, um die Gesamtmenge der embryonalen DNA zu verbessern, und die Amplifikationsrate der kombinierten Medium/BF-Proben nach WGA betrug 100 % bzw. 97,5 %. Jiao et al.25 erhielten mit der gleichen Methode ebenfalls eine 100%ige Amplifikationserfolgsrate.
Die vorliegende Studie berichtet über ein detailliertes Protokoll, das die Probenvorbereitung für verbrauchte Medien, die NGS-Vorbereitung und die Datenanalyse umfasst. Durch die sorgfältige Entfernung von Kumuluszellen aus den Eizellen wurden in der vorliegenden Studie intrazytoplasmatische Einzelspermieninjektionen (ICSI) und Blastozystenkulturen durchgeführt. Das verbrauchte Medium an Tag 4 Tag 5/Tag 6 wurde für die Vorbereitung der WGA- und NGS-Bibliothek gesammelt. Durch den Einsatz der NICS-Technologie konnte die vorliegende Studie die Vorbereitungsschritte der WGA- und NGS-Bibliothek in ca. 3 h rationalisieren und die nicht-invasiven CCS-Ergebnisse in ca. 9 h erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifikationen und Fehlerbehebung
Wenn die NICS-Ergebnisse mit elterlichem genetischen Material verunreinigt sind, stellen Sie sicher, dass alle Cumulus-Corona-Radiata-Zellen entfernt werden und stellen Sie sicher, dass eine ICSI zur Befruchtung durchgeführt wird. Unsachgemäße Medienlagerung oder Template-Vorbereitungsprozesse werden vermieden, die die DNA abbauen können. Der Arbeitsraum wurde gründlich mit DNase- und RNase-Dekontaminationsreagenzien gereinigt. Um eine Ko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Shiping Bo und Shujie Ma für ihre Unterstützung bei der NGS-Datenanalyse. Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch das National Key Research and Development Program unterstützt (Grant No. 2018YFC1003100).
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
References
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